藥分高效液相色譜法介紹

藥分高效液相色譜法介紹第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日二、高效液相色譜法分類根據(jù)分離機理可分為：吸附色譜鍵合相色譜離子交換色譜大小排阻（凝膠）色譜液-液分配色譜法

第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日（一）吸附色譜分離吸附色譜法是當(dāng)組分分子流經(jīng)固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時，不同組分分子、流動相分子就要對吸附劑表面的活性中心展開競爭。這種競爭能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。

第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日（二）鍵合相色譜分離鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。

第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日（三）離子交換色譜分離離子交換色譜法是流動相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進行可逆交換時，它們對交換劑的基體離子親和力大小的不同而達到分離的。組分離子對交換劑基體離子親和力越大，保留時間就越長。

第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日（四）大小排阻色譜分離

大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴散進入細孔中，保留時間最長；大分子完全排斥在孔外，隨流動相很快流出，保留時間最短。

第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日（五）液-液分配色譜法

分離

液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑,分離時,組分溶入兩相,不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離.目前廣泛使用的化學(xué)鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的,使用化學(xué)鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋.鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位,是應(yīng)用最廣的色譜法.按照固定相和流動相極性的不同,分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類.

第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日1.正相色譜法固定相極性大于流動相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜法,簡稱為正相色譜法。氰基鍵合硅膠,氨基鍵合硅膠等極性的化學(xué)鍵合固定相是正相色譜常用的固定相,正相色譜的流動相一般為極性較小的有機溶劑.在正相色譜中,極性小的組分由于K值較小先流出,極性較大的組分后流出.正相色譜法用于溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)的分離。

第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日2.反相色譜法流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法,簡稱為反相色譜法。反相色譜法使用非極性固定相,最常用的非極性固定相是十八烷基硅烷鍵合硅膠,還有辛烷基硅烷鍵合硅膠等。流動相常用水與甲醇,乙腈或四氫呋喃的混合溶劑。在反相色譜中極大的組分因K值較小先流出色譜柱,極性較小的組分后流出.流動相中有機溶劑的比例增加,流動相極性減小,洗脫力增強.反相色譜法是目前應(yīng)用最廣的高效液相色譜法。

第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日三、高效液相色譜儀簡介高效液相色譜儀主要由：輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日(一)輸液泵

高效液相色譜的流動相采用高壓泵輸送,有不同類型的輸液泵,按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵.目前使用較多的是柱塞式往復(fù)泵。(二)進樣器

進樣器是將試樣送入色譜柱的裝置.一般要求進樣裝置的密封性好,死體積小,重復(fù)性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力,流量影響小。第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日(三)色譜柱色譜柱是色譜分離的核心.為了保證色譜柱的柱效高,使用壽命長,一般使用由專業(yè)化工廠生產(chǎn)的商品柱.色譜柱管多由不銹鋼制成,內(nèi)裝一定的固定相.色譜往長一般10～30cm,內(nèi)徑2～5mm.化學(xué)鍵合相是廣泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠的應(yīng)用最為廣泛。

第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日(四)檢測器樣品經(jīng)色譜柱分離后進入檢側(cè)器進行檢測.按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì),紫外檢測器(UVD),熒光檢測器(ED)屬于這一類,它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),示差折光檢測器(RID),蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測器.

(四)檢測器樣品經(jīng)色譜柱分離后進入檢側(cè)器進行檢測.按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì),紫外檢測器(UVD),熒光檢測器(ED)屬于這一類,它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng);通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),示差折光檢測器(RID),蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質(zhì)譜作為高效液相色譜的檢測器。第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日(五)數(shù)據(jù)記錄處理和計算機控制系統(tǒng)

現(xiàn)代HPLC的特征是用微機控制儀器.HPLC儀器的中心計算機控制系統(tǒng),即能做數(shù)據(jù)采集和分析工作,又能程序控制儀器的各個部件,還能在分析一個試樣之后自動改變條件而進行下一個試樣的分析,許多色譜儀的軟件系統(tǒng)具有方法認證功能,使分析工作更加規(guī)范化.

第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日高效液相色譜的特點

高壓——壓力可達150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速——流速為0.1～10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。

第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日四、高效液相色譜法的應(yīng)用1.在鑒別中的應(yīng)用

在HPLC法中,保留時間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān),是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項下規(guī)定:在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照品主峰的保留時間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進行鑒別。

第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日2.在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用

HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質(zhì)檢查中應(yīng)用廣泛.主要用于藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢查?！坝嘘P(guān)物質(zhì)”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產(chǎn)物,降解產(chǎn)物等物質(zhì),這些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測.若雜質(zhì)是已知的,又有雜質(zhì)的對照品,可用雜質(zhì)對照品做對照進行檢查.若雜質(zhì)是未知的,可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進行檢查。

第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日面積歸一化法

測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內(nèi)。色譜的記錄時間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時間決定，除另有規(guī)定外,可為該品種項下主成分保留時間的倍數(shù)。

第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期日主成分自身對照法

當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保留時間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計