生物化學(xué)檢驗 大四下課件 血漿脂蛋白

第八章血漿脂蛋白代謝紊亂的生物化學(xué)檢驗

概述血漿脂質(zhì)總量為4.0～7.0g/L。包括：

1.甘油三酯(triacylglycerol/triglyceride，TG).2.總膽固醇(totalcholesterol，TC)

游離膽固醇(freecholesterol，F(xiàn)C)

膽固醇酯(cholesterolester，CE)3.磷脂(Phospholipid，PL)4.游離脂肪酸(freefattyacid，F(xiàn)FA)血脂

Lipid載脂蛋白

ApolipoproteinApo脂蛋白

LipoproteinLP概念脂類+載脂蛋白脂蛋白

血漿脂蛋白(lipoprotein,LP)是血漿脂類的主要存在形式與運輸形式血漿脂蛋白（lipoprotein,LP）定義：脂類不溶或微溶于水，無論是內(nèi)源性或外源性脂類均以溶解度較大的脂蛋白復(fù)合體形式在血液循環(huán)中運輸。

Pro.ChEPLTGFACh脂蛋白結(jié)構(gòu)脂蛋白結(jié)構(gòu)及組成

Lipid(TG、PL、FC和CE）

+Apo疏水核心+親水表層（TG+CE+PL疏水基）

（Apo+PL親水基）

顆粒大小CM>VLDL>LDL>HDL

血漿脂蛋白的分類

1．電泳分類法

乳糜微粒(Chylomicron，CM)

β-脂蛋白(β-LP)前β-脂蛋白(preβ-LP)

α-脂蛋白(α-LP)依據(jù)血漿脂蛋白分子中蛋白質(zhì)表面電荷多少的不同而分離。

通?？煞殖桑?/p>

CM、pre-β-LP、β-LP、α-LP

2．密度分類法

密度最小的為乳糜微粒（CM）

極低密度脂蛋白(VLDL)

低密度脂蛋白(LDL)

高密度脂蛋白(HDL)

CMCM-VLDL

前-LDL-HDL

電泳超速離心血漿脂蛋白

正常人血漿脂蛋白的分類及主要成分

CMVLDLLDLHDL

密度

＜O.940.94—1.0061.006—1.0631.063—1.21蛋白質(zhì)(％)1—26—1018—2245—55甘油三酯(％)85—9550—654—82—7膽固醇(％)游離型

1—34—86—83—5酯型

2—416—2245—5015—20磷脂(％)3—415—2018—2426—32載脂蛋白

載脂蛋白(Apolipoprotein，Apo)是指血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分。載脂蛋白的合成場所、分布、功能及臨床意義載脂蛋白合成場所分布功能臨床意義Apo-A肝、腸HDLAⅠ激活LCATAⅡ抑制LCAT高α脂蛋白血癥Apo-BB100肝B48腸LDLCM受體識別Ⅱ型高脂血癥Apo-C肝VLDLCⅠ激活LCAT及LPLCⅡ激活LPLCⅢ抑帛LPLV型高脂血癥Apo-E肝VLDL（主要）HDL受體識別HDL形成IV型高脂血癥載脂蛋白的生理功能(1)結(jié)構(gòu)功能(2)調(diào)節(jié)功能(3)識別功能

三、脂蛋白受體LDL受體VLDL受體清道夫受體（一）低密度脂蛋白受體由836個氨基酸殘基組成，分子量約115kD，五個不同的區(qū)域構(gòu)成受體親和性:含ApoB100的脂蛋白（LDL；VLDL；β-VLDL）可與LDL受體以高親和力結(jié)合。LDL受體途徑（LDLreceptorpathway）若胞內(nèi)游離膽固醇濃度升高，則：①抑制HMGCoA還原酶，以減少自身的膽固醇合成；②抑制LDL受體基因的表達(dá)，減少LDL受體的合成，從而減少LDL的攝??；③激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ACAT，使游離膽固醇在胞質(zhì)內(nèi)酯化成膽固醇酯貯存，以供細(xì)胞的需要。（二）極低密度脂蛋白受體

結(jié)構(gòu)與LDL受體類似。對VLDL、VLDL殘粒有高親和性結(jié)合，對LDL為顯著的低親和性。在肝內(nèi)幾乎未發(fā)現(xiàn)，廣泛分布在代謝活躍的心肌，骨骼肌、脂肪組織等細(xì)胞.VLDL受體不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇負(fù)反饋抑制?？赡芘c肥胖成因有關(guān)（三）清道夫受體

(scavengerreceptor，SR)

◆清道夫受體結(jié)構(gòu)◆清道夫受體配體

oxLDL,LDL,HDL,VLDL;參與脂質(zhì)代謝◆功能：*使巨噬細(xì)胞泡沫化，促進(jìn)粥樣斑塊的形成；*清除血管過多脂質(zhì)和病菌毒素。四、血漿脂蛋白的代謝

（一）血漿脂蛋白代謝密切相關(guān)的酶類參與脂質(zhì)代謝的酶有：脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）肝脂酶（hepatictriglyceridelipase，HTGL）LCAT(lecithincholesterylacetyltransferase)CETP(cholesterolestertransferprotein)一、LPL(lipoproteinlipase,脂蛋白脂肪酶)

（一）來源

脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞等合成。

化學(xué)本質(zhì)：糖蛋白，60kD

（二）功能

1．（主要）水解CM、VLDL中的TG

TG甘油一酯+FFA

2．促進(jìn)脂蛋白之間PL、Apo和Ch的轉(zhuǎn)換

（三）活性的調(diào)節(jié)

ApoCⅡ為活化劑

無活性有活性

ApoCⅡ二、肝酯酶（hepaticlipase,或hepatictriglyceridelipase,HTGL,HL，肝甘油三酯脂肪酶）

(一)來源：肝實質(zhì)細(xì)胞

糖蛋白，53kD

（二）活性調(diào)節(jié)

不需要ApoCⅡ作為活化劑

（三）功能

1．主要（水解）VLDL及其殘粒、β-VLDL中的TG

2．主要作用于小顆粒脂蛋白

3.調(diào)節(jié)膽固醇從周圍組織轉(zhuǎn)運到肝，使VLDL轉(zhuǎn)變?yōu)長DL三、LCAT(lecithin-cholesterolacyltransferase,卵磷脂-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)

(一)來源與特性

由肝合成，在血液中發(fā)揮催化作用。糖蛋白，含416個氨基酸殘基，63kD。

(二)功能

1.(主要)催化HDL中的FC→CE，CE進(jìn)入HDL核心儲存。

卵磷脂F(xiàn)C

溶血卵磷脂CE

2.參與Ch的逆向轉(zhuǎn)運和組織中過量Ch的清除。四、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白

(cholesterolestertransferprotein,CETP),亦稱為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(LTP)

(一)來源與性質(zhì)

由肝、小腸、腎上腺、脂肪組織和巨噬細(xì)胞等合成。疏水性蛋白質(zhì)，74kD

(二)功能：促進(jìn)脂蛋白之間脂類的交換，參與血漿膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運。

膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運：肝外→肝(1)肝外組織細(xì)胞的FC結(jié)合至HDL上

(2)在HDL中，F(xiàn)CCE

HDL核心(儲存)

轉(zhuǎn)移至VLDL、LDL上

(3)肝細(xì)胞通過相應(yīng)受體攝取VLDL、LDL

上述作用是由CETP、LCAT和HDL等協(xié)同完成的

若缺乏CETP，則HDL中的CE不能運出，導(dǎo)致血漿HDL-c↑

CE血漿脂蛋白代謝

1．乳糜微粒(CM)

CM是運輸外源性甘油三酯的主要形式，呈球形，直徑在80-500nm。CM有強烈的光散射作用，餐后大量CM進(jìn)入血液可使血漿產(chǎn)生混濁，稱為乳糜血。CM可飄浮到血漿表面形成一“奶油”層。

2．極低密度脂蛋白(VLDL)

VLDL是血液中第二種富含甘油三酯的脂蛋白，密度為0.96-1.006，呈球形，核心部分為非極性脂類，表面為單層極化分子。VLDL主要在肝合成，是內(nèi)源性甘油三酯的轉(zhuǎn)運形式。3．低密度脂蛋白(LDL)

LDL密度為1.006--1.063，是運載膽固醇的主要脂蛋白。呈圓球形核心部位為非極性脂類，主要是膽固醇酯。LDL代謝LDL受體代謝途徑

LDL↑∝AS、CHD4.高密度脂蛋白HDL

周圍組織的FC

肝盤狀HDL（FC）肝外細(xì)胞（清除膽固醇）

LCATCETP

球狀HDL（CEApoE）

肝代謝（膽汁酸等）脂蛋白(α)Lp（α

）β－脂蛋白抗原成分結(jié)構(gòu)類似LDL，含Apo（α

），但分子量大、顆粒較大，電泳較慢。與纖溶酶原有高度同源性是心腦血管病的獨立危險因子，與糖尿病、腎病、炎癥等密切相關(guān)

Apo(a)

三環(huán)式結(jié)構(gòu)

分布：主要包含在血漿LP(a)中。LP(a)也是正常存在于血漿中的一種脂蛋白，但人群間濃度差異甚大，0~1000mg/L

來源：肝

不受性別、年齡、體重、適度鍛煉和降膽固醇藥物的影響。有待于大量的實驗依據(jù)和臨床觀察不斷地深入研究第六節(jié)脂蛋白代謝紊亂

血漿脂類及脂蛋白的水平受到多種基因及環(huán)境的影響，脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致脂類或脂蛋白濃度異常，臨床上以脂蛋白代謝紊亂、代謝綜合征和動脈粥樣硬化最常見由某種原因?qū)е碌闹鞍状x紊亂，其基本表現(xiàn)為血漿脂蛋白水平異常改變。

主要為高脂蛋白血癥（Hyperlipoproteinemia），也稱為為“高脂血癥”（Hyperlipidemia）。

以高脂血癥最常見。

血漿脂蛋白異常代謝高脂血癥、低脂血癥低HDL血癥、高HDL血癥

原發(fā)性

繼發(fā)性P125

分型的生化檢驗依據(jù)為：

(1)血清(血漿)外觀：在4℃冰箱放置12h后的血清外觀。透明(清亮)?混濁？有無奶油樣層？

(2)血脂濃度：血清TG、TC含量

(3)血清LP電泳圖譜：某種(些)LP含量(%)是否升高(相應(yīng)區(qū)帶是否深染、加寬?)一、原發(fā)性高脂蛋白血癥（primaryhyperlipoproteinemia）

正常情況：

血清外觀清亮、透明、均勻

TG0.56~1.70mmol/L(50~150mg/dl)

TC3.10~5.70mmol/L(120~220mg/dl)

血清LP電泳圖譜正常

α—LP0.23~0.52

前β—LP0~0.30

β—LP0.35~0.60(供參考)

CM0

空腹血脂一、原發(fā)性脂蛋白代謝紊亂1976年Fredrickson等將其以表現(xiàn)型為基礎(chǔ)分為六型，分別考慮了血清4℃過夜后的外觀、血脂檢測指標(biāo)以及血清脂蛋白電泳等。此種分類方法每種分型都沒有對應(yīng)特定一種疾病，而是將血脂水平表現(xiàn)相似的疾病歸為一類，只作為了描述脂蛋白異常的一種方法。隨著研究的深入，尤其是遺傳和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，運用分子診斷技術(shù)對載脂蛋白進(jìn)行基因分型，輔助臨床對疾病的診治。

原發(fā)性高脂蛋白血癥分型及特征

分型Lp血脂Apo

外觀病因

Ⅰ型

CMTC-TGB48A,C上：奶油下：透明

LPL缺陷CⅡ缺乏

Ⅱa型LDLTCB100透明-LDL受體缺陷Ⅱb型LDLVLDLTCTGBCⅡCⅢ混濁不明Ⅲ型(寬β病)IDLTCTGCⅡCⅢE混濁ApoE異常Ⅳ型VLDLTC-TGCⅡCⅢ混濁不明Ⅴ型CMVLDLTGTGCⅡCⅢE奶油混濁LPL缺陷,使CMVLDL處理↓血清外觀分析血清清澈（TG正常）測定TCTC正常：正常人TC：Ⅱa型混濁（TG）4°C過度上層有“奶油”層（CM）均勻混濁（VLDL）下層清澈（VLDL）I型下層混濁（VLDL）V型TC：Ⅱb型、ⅢTC正常：Ⅳ型簡易分型：高TC血癥高TG血癥高TC合并高TG混合型高脂血癥低HDL血癥第三節(jié)

脂蛋白代謝紊亂的生物化學(xué)檢驗一、血漿脂質(zhì)測定二、血漿脂蛋白測定三、血漿載脂蛋白測定四、血漿脂代謝相關(guān)酶的測定五、脂質(zhì)相關(guān)蛋白基因突變分析六、血脂和脂蛋白檢測的臨床應(yīng)用P95一、血漿脂質(zhì)測定（一）TG測定

1．化學(xué)法

2．酶法測定（二）TC測定

1．化學(xué)法

2．酶法測定（三）FFA測定（四）磷脂測定（一）甘油三酯測定

1．化學(xué)法

基本操作步驟包括：①抽提分離（有機溶劑），去除干擾物—PL、FG等（吸附劑）或分溶抽提；②皂化使TG水解生成甘油；氧化甘油氧化成甲醛；④顯色定量甲醛。

A.甲醛與變色酸在硫酸溶液中加熱產(chǎn)生紫紅色（Eegriwe反應(yīng)），570nm測定吸光度。

B.甲醛與乙酰丙酮在銨離子存在下加熱生成黃色的產(chǎn)物（Hantgsch反應(yīng)），412nm測定吸光度。2．甘油三酯酶法測定評價：操作簡便，快速準(zhǔn)確，并能在自動化生物化學(xué)分析儀上進(jìn)行批量測定。

TG參考范圍與臨床意義血清TG參考范圍：成人0.45-1.69mmol/L（40-150mg/dl）。目前我國的血脂異常防治建議提出，成年人的合適TG水平≤1.69mmol/L（150mg/dl）；＞1.69mmol/L為TG升高。TG升高可見于家族性高TG血癥、家族性混合性高脂血癥、冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病綜合癥、甲狀腺功能減退、膽道梗塞、糖原累積癥、妊娠、口服避孕藥、酗酒等。（二）總膽固醇測定血清中膽固醇：CE占70％；FC占30％。測定方法分為化學(xué)法和酶法兩大類。1．化學(xué)比色法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黃皂苷沉淀純化；④顯色比色四個階段。代表性的方法：（1）硫磷鐵法（Bowman法）：用無水乙醇提取膽固醇，沉淀蛋白質(zhì)，提取液中加硫磷鐵試劑顯色。（2）Abell法：血清中加入氫氧化鈉乙醇溶液，使CE皂化為FC；加入正己烷-水提取后，F(xiàn)C進(jìn)入正己烷相，以醋酐-硫酸試劑顯色定量。2.總膽固醇酶法測定（1）CE在膽固醇酯酶(cholesterolesterase，CHE)作用下水解成FC和FFA；（2）FC再經(jīng)膽固醇氧化酶(cholesteroloxidase，COD)氧化成△4膽甾烯酮和H2O2；（3）再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4膽甾烯酮生成量，以作為FC的定量依據(jù)。A.測定△4膽甾烯酮法240nmB.定量O2的消耗電位測量C.測定H2O2的生成量TC參考范圍與臨床意義血清TC參考范圍：成人2.85-5.69mmol/L（110-220mg/dl）。高膽固醇血癥和AS的發(fā)生有密切關(guān)系。TC升高見于各種高脂蛋白血癥、梗阻性黃疸、腎病綜合征、甲狀腺功能低下、慢性腎功能衰竭、糖尿病等。此外，吸煙、飲酒、緊張、血液濃縮等也可使TC升高。TC降低見于各種脂蛋白缺陷狀態(tài)、肝硬化、惡性腫瘤、營養(yǎng)不良、巨細(xì)胞性貧血等。（三）游離脂肪酸測定

FFA在血中濃度很低，成人0.4～0.9mmol/L；兒童和肥胖成人稍高。FFA測定標(biāo)本：在4℃條件下分離血清并進(jìn)行測定。血清FFA測定方法：

1．非酶法測定非酶法測定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高效液相層析法。前三種方法準(zhǔn)確性差，高效液相層析法儀器太昂貴，不便于批量操作。

2．酶法測定血清中主要用脂肪酶測定?？煞謩e測定產(chǎn)物乙酰CoA，進(jìn)行定量。酶法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠快速，易于批量檢測。（四）磷脂測定血清中PL包括：卵磷脂(60％)；溶血卵磷脂(2％～10％)；磷脂酰乙醇胺等(2％)；鞘磷脂(20％)。血清PL定量方法:1．化學(xué)測定法①抽提分離；②灰化；顯色、比色。

2．酶測定法可分別利用磷脂酶A、B、C、D等4種酶作用，水解，測定其產(chǎn)物，對PL進(jìn)行定量，多采用磷脂酶D(PL-D)。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含膽堿的磷脂，這三種磷脂約占血清總磷脂的95％。該法快速準(zhǔn)確，便于自動化儀器進(jìn)行批量檢測。二、血漿脂蛋白測定（一）電泳法（二）超速離心法（三）脂蛋白膽固醇測定1．沉淀分離法

2．均相測定法

3．間接法（四）Lp(a)測定二、血漿脂蛋白測定

（一）電泳分離法原理：根據(jù)血漿脂蛋白電泳遷移率不同予以判斷確認(rèn)。方法：（1）預(yù)染、電泳:如蘇丹黑B等預(yù)染后電泳；（2）掃描、計算：置于光密度計內(nèi)進(jìn)行掃描，計算出各種脂蛋白的百分比。電泳支持物一般常用醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠。（二）超速離心分離純化法操作方法：將血漿置于密度梯度的鹽溶媒介質(zhì)中，在強大離心力作用下，各脂蛋白分散于離心管中的密度梯度溶媒層，達(dá)到分離純化的目的。超速離心法是分離純化脂蛋白的有效技術(shù),目前廣泛應(yīng)用于脂蛋白、載脂蛋白代謝的研究中。

（三）血漿脂蛋白膽固醇測定脂蛋白中膽固醇含量較為穩(wěn)定，因此目前以測定脂蛋白中膽固醇總量的方法作為脂蛋白的定量依據(jù)。高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)極低密度脂蛋白-膽固醇(VLDL-C)1.沉淀分離法原理：脂蛋白的組成及理化性質(zhì)不同，在不同的聚陰離子、2價金屬離子(Mn2+，Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)及不同pH值條件下，使脂蛋白與聚陰離子結(jié)合形成復(fù)合物沉淀，以達(dá)到分離定量各種脂蛋白的目的。方法：（1）肝素-錳沉淀血清中VLDL和LDL，離心沉淀，HDL則留在上清液，再定量HDL-C量，即為血漿HDL的量。（2）聚乙烯硫酸鹽沉淀LDL，離心去上清液留沉淀。再定量沉淀其中的LDL-C，即血漿的LDL量。評價：操作簡單，無需昂貴的儀器，是臨床應(yīng)用的檢測方法。

2．勻相測定法

（1）血漿高密度脂蛋白膽固醇測定

原理：CM、VLDL、LDL在多聚陰離子存在下與試劑Ⅰ發(fā)生凝集形成遮避圈，抑制其表面的游離膽固醇反應(yīng)或試劑Ⅰ與CM、VLDL、LDL中的膽固醇反應(yīng)生成H2O2，并將H2O2清除；試劑Ⅱ與HDL形成可溶性復(fù)合體，使HDL中的膽固醇直接與酶試劑反應(yīng)。過氧化物酶清除法測定HDL-C在血清中加入試劑Ⅰ，在反應(yīng)促進(jìn)劑（合成的多聚物/表面活性劑）的作用下，血清中CM、VLDL及LDL與試劑形成可溶性復(fù)合物，其表層的FC在CHOD的催化下反應(yīng)生成H2O2，H2O2在POD的作用下被清除。加入試劑Ⅱ，與HDL顆粒成為可溶性復(fù)合物，HDL中的膽固醇與膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶反應(yīng)，生成H2O2，并作用于色原體產(chǎn)生顏色反應(yīng)，其顏色的深淺與HDL-C的含量成正比。HDL-C參考范圍與臨床意義血清HDL-C參考范圍：成年男性1.16-1.42mmol/L（45-55mg/dl）女性1.29-1.55mmol/L（50-60mg/dl）HDL-C與冠心病的發(fā)展成負(fù)相關(guān)。HDL-C降低見于急性感染、糖尿病、慢性腎功能衰竭、腎病綜合征等。HDL-C含量過高（如超過2.6mmol/L），也屬于病理狀態(tài)，為高HDL血癥。高HDL血癥可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。（2）血漿LDL-C測定——表面活性劑清除法SUR法檢測原理：試劑Ⅰ中的表面活性劑1能改變LDL以外的脂蛋白（HDL、CM和VLDL等）結(jié)構(gòu)并解離，所釋放出來的微?；懝檀挤肿优c膽固醇酶試劑反應(yīng)，產(chǎn)生的H2O2在缺乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色；加試劑Ⅱ，表面活性劑2使LDL顆粒解離釋放膽固醇，參與Trinder反應(yīng)而顯色，色澤深淺與LDL-C量呈比例。LDL-C參考范圍與臨床意義血清LDL-C參考范圍：成人2.07~3.11mmol/LLDL是AS的主要危險因素之一。血清LDL-C水平隨年齡、高脂、高熱量飲食、運動少和精神緊張升高。LDL-C升高可見于家族性高膽固醇血癥、家族性apoB缺陷癥、混合性高脂血癥、糖尿病、甲狀腺功能低下、腎病綜合征、梗阻性黃疸、慢性腎功能衰竭、Cushing’s綜合征、妊娠、多發(fā)性肌瘤、某些藥物的使用等。LDL-C降低見于家族性無β或低β-脂蛋白血癥、營養(yǎng)不良、甲狀腺功能亢進(jìn)、消化吸收不良、肝硬化、慢性消耗性疾病、惡性腫瘤等。（四）Lp(a)測定法目前主要采用免疫透射比濁法（ITA）、免疫散射比濁法(INA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、發(fā)射免疫測定法（RIA）和免疫擴散法（RID）。免疫透射比濁法：利用Apo(a)的單克隆抗體，與Apo(a)結(jié)合進(jìn)行測定，該法靈敏度高，便于自動化批量檢測。Lp(a)-C測定法：避免或減少因為抗原Apo(a)多態(tài)性不同所造成的Lp(a)定量的準(zhǔn)確性。測定方法有超速離心法、麥胚血凝素法和瓊脂糖凝膠電泳法，后兩種方法在臨床應(yīng)用較廣。參考值：300mg/L以下三、載脂蛋白測定血清載脂蛋白(Apo)包括ApoAI、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a)，已屬常規(guī)檢測項目。血清中載脂蛋白均結(jié)合于脂蛋白中，測定時要加用解鏈劑，使脂蛋白中Apo暴露再進(jìn)行測定。目前測定血清中載脂蛋白的含量的方法是利用相應(yīng)特異抗體試劑進(jìn)行測定?，F(xiàn)有羊抗人ApoAI、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a)等抗體試劑。測定原理是將某一特異抗體加到待測人血清中，即與血清中相應(yīng)抗原形成抗原抗體復(fù)合物，根據(jù)復(fù)合物的