生物技術(shù)制藥課件 6酶工程制藥-1

第七章酶工程制藥1第一節(jié)概述一、酶工程簡介（EnzymeEngineering）酶工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、發(fā)展而形成的一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。2酶工程的名稱出現(xiàn)在20世紀(jì)20年代，主要指自然酶制劑在工業(yè)上的規(guī)模應(yīng)用。1953年，德國人提出了酶固定化技術(shù)。1969年，日本人用固定化技術(shù)拆分了DL-氨基酸。1971年，第一屆國際酶工程會議提出酶工程的主要內(nèi)容：酶的生產(chǎn)、分離純化、酶的固定化、酶及固定化的反應(yīng)器、酶和固定化酶的應(yīng)用。3一、酶的基礎(chǔ)知識（一）酶是生物催化劑酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。催化高效性專一性：結(jié)構(gòu)專一性；立體異構(gòu)專一性酶具有不穩(wěn)定性4（二）酶的化學(xué)本質(zhì)蛋白質(zhì)酶單純酶結(jié)合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶

與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔基與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑

金屬離子作為輔助因子。5二、現(xiàn)代酶工程的主要內(nèi)容：1.酶的分離純化、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開發(fā)；2.酶和細(xì)胞的固定化及酶反應(yīng)器的研究，包括酶傳感器、反應(yīng)檢測；3.酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶的研究；4.酶的分子改造和化學(xué)修飾，結(jié)構(gòu)與功能的研究；65.有機(jī)相中酶反應(yīng)的研究；6.酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)與應(yīng)用研究；7.抗體酶、核酸酶的研究；8.模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計、合成研究。7三、酶的來源

酶的來源：酶的生產(chǎn)目前多數(shù)直接從生物體中提取分離。非常少的是合成,基因工程.早期酶的生產(chǎn)多以動植物為主要原料，如激肽釋放酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年來，研究發(fā)展了動植物組織培養(yǎng)技術(shù)，但周期長、成本高。工業(yè)生產(chǎn)一般都以微生物為主要來源。目前使用的千余種商品酶，大多數(shù)是微生物生產(chǎn)的。8目前常用的產(chǎn)酶微生物

E.coli

：是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌。分泌胞內(nèi)酶，經(jīng)細(xì)胞破碎分離得到。在工業(yè)上用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶枯草桿菌：主要用于生產(chǎn)α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、堿性磷酸脂酶。曲酶（黑曲酶和黃曲酶）：主要生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；负椭久?四、酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1.在疾病診斷方面的應(yīng)用由于酶具有專一性強(qiáng)、催化效率高、作用條件溫和等顯著的催化特點(diǎn)，酶學(xué)診斷已經(jīng)發(fā)展成為可靠、簡便又快捷的診斷方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。酶學(xué)診斷方法包括兩個方面，一是根據(jù)體內(nèi)原有酶活力的變化來診斷某些疾病，二是利用酶來測定體內(nèi)某些物質(zhì)的含量，從而診斷某些疾病。10酶疾病與酶活力變化淀粉酶胰臟疾病，腎臟疾病時升高；肝病時下降堿性磷酸酶佝僂病、軟骨化病、骨瘤、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)時，活力升高；軟骨發(fā)育不全等，活力下降谷丙草轉(zhuǎn)氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌，活力增高至200單位以上，阻塞性黃疸、肝硬化、膽道癌等，血清中酶活力升高乳酸脫氫酶肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力顯著升高；肝硬化，活力正常端粒酶癌細(xì)胞中含有端粒酶，正常體細(xì)胞內(nèi)沒有端粒酶活性乳酸脫氫酶同工酶LDH心肌梗塞、惡性貧血，LDH1增高；白血病、肌肉萎縮，LDH2增高；白血病、淋巴肉瘤、肺癌，LDH3增高；轉(zhuǎn)移性肝癌、結(jié)腸癌，LDH4增高；肝炎、原發(fā)性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外傷、骨折，LDH5增高葡萄糖氧化酶測定血糖含量，診斷糖尿病亮氨酸氨肽酶（LAP）肝癌、陰道癌、阻塞性黃疸，活力明顯升高(1)根據(jù)體內(nèi)酶活力的變化診斷疾病:11酶測定的物質(zhì)用途葡萄糖氧化酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病葡萄糖氧化酶+過氧化物酶葡萄糖測定血糖、尿糖，診斷糖尿病尿素酶尿素測定血液、尿液中尿素的量，診斷肝臟、腎臟病變谷氨酰胺酶谷氨酰胺測定腦脊液中谷氨酰胺的量，診斷肝昏迷、肝硬化膽固醇氧化酶膽固醇測定膽固醇含量，診斷高血脂等DNA聚合酶基因通過基因擴(kuò)增，基因測序，診斷基因變異、檢測癌基因(2)用酶測定體液中某些物質(zhì)的變化診斷疾?。?22.在疾病治療方面的應(yīng)用-酶類制劑

酶可以作為藥物治療多種疾病，用于治療疾病的酶稱為藥用酶。藥用酶具有療效顯著，副作用小的特點(diǎn)，在疾病的治療方面的應(yīng)用越來越廣泛13消化類：研究最早，是品種最多的一類酶.在這一類酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無花果酶、菠蘿酶等。健美生消化酶—幫助腸胃蠕動14抗炎凈創(chuàng)類：目前在治療上發(fā)展最快，用途最廣的一種。多數(shù)是蛋白質(zhì)水解酶，分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能夠分解膿液中的核蛋白使成簡單的嘌呤和嘧啶，降低膿液的粘性、達(dá)到凈潔創(chuàng)口、消除癡皮、排除膿液抗炎消腫的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶，α-淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等。15血凝和解凝類：這類酶都是從血液中提取出來的。凝血酶的作用是促使血中纖維蛋白元變成不溶性纖維蛋白,從而促使血液凝固，防止微血管出血。纖維蛋白溶解酶的作用是溶解血塊，為目前臨床上最新的一種酶制品,治療血栓靜脈炎、冠狀動脈栓塞等。抑肽酶作為肽酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于體外循環(huán)手術(shù)，大劑量抑肽酶可明顯減少心臟外科手術(shù)后的滲血，消除因心臟外科手術(shù)后滲血而導(dǎo)致的死亡16凝血酶17栓溶酶類與心血管疾病18解毒類：主要作用是解除體內(nèi)或因注射某種藥物產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)。主要品種有青霉素酶、過氧化氫酶和組織胺酶等。青霉素酶能夠分解青霉素分子中的β一內(nèi)酰胺環(huán)，使變成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的過敏反應(yīng)。

19酶名來源用途（治療）淀粉酶胰臟、麥芽、微生物消化不良，食欲不振蛋白酶胰臟、胃、微生物消化不良，消炎，消腫，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合脂肪酶胰臟、微生物治療消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、細(xì)菌治療各種細(xì)菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治療心肌梗塞，結(jié)膜下、黃斑部出血鏈激酶鏈球菌治療血栓性靜脈炎，血腫，下出血青霉素酶蠟狀芽孢桿菌治療青霉素引起的變態(tài)反應(yīng)SOD酶微生物，植物，動物輻射損傷，紅斑狼瘡，皮肌炎，結(jié)腸炎凝血酶動物，蛇治療各種出血病膠原酶細(xì)菌分解膠原，消炎，化膿，脫痂，右旋糖酐酶微生物預(yù)防齲齒膽堿酯酶細(xì)菌治療皮膚病，支氣管炎，氣喘溶纖酶蚯蚓溶血栓彈性蛋白酶胰臟治療動脈硬化，降血脂尿酸酶牛腎治療痛風(fēng)20溶菌酶213.在藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗幬?。這方面的應(yīng)用日益增多。現(xiàn)已有不少藥物包括一些貴重藥物都是由酶法生產(chǎn)的

22

酶主要來源用途（制造、生產(chǎn)）青霉素?；肝⑸锇牒铣汕嗝顾睾皖^孢菌素11-β-羥化酶霉菌氫化可的松L-酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶細(xì)菌多巴（L-二羥苯丙氨酸）β-酪氨酸酶植物多巴α-甘露糖苷酶鏈霉菌高效鏈霉素核苷磷酸化酶微生物阿糖腺苷酰基氨基酸水解酶微生物生產(chǎn)L-氨基酸5’-磷酸二酯酶桔青霉等微生物生產(chǎn)各種核苷酸多核苷酸磷酸化酶微生物生產(chǎn)聚肌胞，聚肌苷酸無色桿菌蛋白酶細(xì)菌豬胰島素轉(zhuǎn)變?yōu)槿艘葝u素核糖核酸酶微生物生產(chǎn)核苷酸蛋白酶動物、植物、微生物生產(chǎn)L-氨基酸β-葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物生產(chǎn)人參皂甙-Rh223青霉素酰化酶與抗生素改造24252627五、酶類藥物的發(fā)展

1987年，第一種重組酶類藥物Activase（Genentech公司，栓類藥tPA）誕生，治療由冠狀動脈阻塞引起的心臟病。AdAgen(腺苷脫氨酶,阿達(dá)根)：腺苷脫氨酶缺乏癥患者,T淋巴細(xì)胞因代謝產(chǎn)物的累積而死亡,從而引起免疫功能缺陷。PEG-ADA酵素，可以減少多余腺苷,1990年被批準(zhǔn)用于治療缺乏腺苷脫氨酶而造成的重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)。AdAgen是第一種在美國罕用藥法案下經(jīng)FDA批準(zhǔn)的酶類藥物。28美國罕用藥法案(OrphanDrugAct)是1983年為鼓勵制藥公司研制那些用于治療少數(shù)人所患疾病而制定的法案,(7年的市場獨(dú)占期,并允許臨床研究成本進(jìn)行稅收抵扣)。孤兒藥：是用于診斷、預(yù)防或治療致命或非常嚴(yán)重的罕見疾病的藥物

Activase和AdAgen的批準(zhǔn)，標(biāo)志著酶類藥物新時代的到來，可以補(bǔ)充其他藥物的不足。生物化學(xué)反應(yīng)依賴于催化，酶類藥物在血液病、遺傳病、灼傷清除,傳染性疾病、癌癥等治療方面有廣泛的前景。291酶類藥物治療遺傳性疾病

AdAgen用于治療SCID，成為第一種成功治療遺傳性疾病的酶類藥物。Ceredase(葡糖腦苷脂酶):治療葡糖腦苷脂酶缺乏病，該病是葡糖神經(jīng)鞘脂類分解代謝中起作用的葡糖腦苷脂酶功能活性降低引起的。在這種酶替代治療中，酶類藥物靶向攻擊體內(nèi)病灶。重組技術(shù)促進(jìn)了該酶的批量生產(chǎn)。于1994年由FDA批準(zhǔn)上市。牛乳糖苷酶缺乏癥。從酵母菌菌種發(fā)酵制備牛乳糖苷酶．已應(yīng)用于臨床30目前至少治療3種黏多糖儲積病(MPS)的酶替代治療正在研究中及上市。黏多糖儲積病是黏多糖代謝的先天性缺陷，均由于缺乏特異性降解性溶菌體酶所致，患者多以黏多糖尿、身材矮小及脂肪軟骨營養(yǎng)不良為特征。31Aldurazyme(BioMarin制藥公司，玻璃酸酶類藥物)，已經(jīng)成功進(jìn)行了MPSI的酶替代治療，2003年上市。亨特病(Hunter’sdisease)屬于MPSⅡ，是由于缺乏硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶引起的黏多糖代謝的x_連鎖的隱性先天性缺陷，用于治療亨特病的Aryplase(BioMarin制藥公司,重組N-乙酰半乳糖胺4-硫化酶，?；蛩狨ッ窧,

arylsulfatase

),2004年上市Naglazyme用于粘多糖病第六型，200５年上市322酶類藥物治療消化道疾病

酶類藥物可以治療很多消化性疾病。利用酶作為消化促進(jìn)劑，改善胃腸道功能口服肽酶可以治療由于攝入一種富含脯氨酸的麥醇溶蛋白引起的營養(yǎng)不良綜合征：口炎性腹瀉。先天性蔗糖酶一異麥芽糖酶缺陷癥(CSID)，可以利用由酵母中提取出的呋喃果糖苷水解酶，即藥酵母蔗糖來進(jìn)行口服治療。CSID的特點(diǎn)是患者的蔗糖糖酶活性缺乏，異麥芽糖酶活性降低。33苯丙酮酸尿癥,體內(nèi)缺失苯基丙氨酸羥化酶。Phenylase(BioMarin,

苯基丙氨酸氨裂解酶,PAL)可在胃腸道中降解苯基丙氨酸。FDA批準(zhǔn)DNA酶(阿法鏈道酶,Dornasea)用于治療肺囊性纖維化。Dornase可以溶解肺內(nèi)的黏液,可以通過降低支氣管肺泡灌洗中的金屬蛋白酶基質(zhì)來減少肺部組織的破壞

。胰腺含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，對營養(yǎng)吸收障礙大有幫助。這些酶還可以治療胰腺功能不全，防止遺傳性胰腺病囊性纖維化。胰腺酶混合物TheracLEcTotal，已經(jīng)于2002年作為罕用藥成功上市。343酶類藥物治療損傷組織

細(xì)菌和植物中的蛋白水解酶一直用來清除灼傷后的死皮。但是所用酶的質(zhì)量和純度往往達(dá)不到要求，人們漸漸改用它法。重組技術(shù)的引進(jìn)大大提高酶的質(zhì)量和純度。酶類藥物又開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)。膠原酶清創(chuàng)局部灼傷已經(jīng)有了令人鼓舞的結(jié)果。軟骨素酶用于治療脊椎損傷，可以促進(jìn)受傷脊椎的再生。軟骨素酶除去神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕中積聚的硫酸軟骨素，而后者正是抑制神經(jīng)軸突生長的元兇。玻璃酸酶也具有水解硫酸軟骨素的活性，同時有助于損傷的神經(jīng)組織的再生。354酶類藥物治療傳染性疾病

溶解酵素：由于可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的糖鏈，在食品等領(lǐng)域一直用作抗菌劑。它還存在RNA酶A和泌尿系統(tǒng)RNA酶U可以選擇性地降解病毒RNA，因此還表現(xiàn)出抗HIV活性。幾丁質(zhì)酶：真菌、原生動物、寄生蟲等許多致病微生物的細(xì)胞壁都含有幾丁質(zhì)，抗菌劑的靶位。溶菌酶：則可以殺死肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，其本身可以治療感染，而且不會產(chǎn)生新的耐藥性菌株。365酶類藥物治療癌癥

PEG化的精氨酸脫氨酶、精氨酸降解酶等可以抑制人體惡性黑素瘤、肝臟癌細(xì)胞的生長，這些癌細(xì)胞都是精氨酸營養(yǎng)缺陷型的，缺乏精氨琥珀酸酯合成活性而不能獨(dú)立生長。37Oncaspar(安龍藥業(yè)，PEG-aspargase)是一種PEG化天冬酰胺酶，94年批準(zhǔn)用于臨床治療急淋。該酶選擇性地消耗某些類型瘤組織的營養(yǎng)成分，而正常細(xì)胞能自身合成天冬酰胺酶故不受影響。正常細(xì)胞可以合成天冬酰胺酸，而癌細(xì)胞卻不能合成，只能依靠天冬酰胺酸降解酶的存在維持生命。天冬酰胺酶及PEG-天冬酰胺酶輔助化療都是非常有效的，目前的關(guān)鍵是PEG-天冬酰胺酶的生產(chǎn)成本較高，較難普及。38軟骨素酶，除去硫酸軟骨素蛋白多糖可以抑制腫瘤的惡性生長。利用化療方法來治療癌癥的副作用是尿酸過多。尿酸氧化酶可以降解難溶性尿酸。近幾年，有5種利用該酶的酶類藥物獲得FDA的批準(zhǔn)。法國Sanofi

Synthelabo公司生產(chǎn)的重組尿酸氧化酶，由黃曲霉培養(yǎng)液純化而得，治療高尿酸血癥療效較好，其PEG化型酶減輕了免疫反應(yīng)，提高了半衰期，得到了較好的應(yīng)用。39世界四大酶制劑公司

1.丹麥諾維信酶制劑公司，全球最大的酶制劑公司。公司產(chǎn)品占有中國50%的工業(yè)酶制劑市場。在天津有生產(chǎn)基地，并在全國都有分廠和合作工廠。有75類將近600種不同酶制劑產(chǎn)品,食品飼料為主.2.世界第二大酶制劑公司美國杰能科genencor,

全球?市場分額.無錫新工廠

403.德國AB酶制劑公司,

主要產(chǎn)品：果膠酶，果漿酶，纖維素酶，蛋白酶，α-淀粉酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶，甘露聚糖酶等4.比利時BELDEM41國內(nèi)現(xiàn)狀無錫市酶制劑廠是第一個專業(yè)酶制劑廠,1965。目前全國有100余家生產(chǎn)企業(yè)，產(chǎn)量到32萬噸，品種20余種，近20年間年產(chǎn)量的平均增長率超過20%。差距和問題，產(chǎn)品品種少，結(jié)構(gòu)不合理；生產(chǎn)規(guī)模小，生產(chǎn)水平低，產(chǎn)品質(zhì)量差；開發(fā)能力差，精細(xì)化程度低。421、細(xì)胞破碎2、酶的提取3、酶的分離方法4、酶的組合分離純化策略5、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶第二節(jié)酶的分離純化(復(fù)習(xí))43酶的分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。44第三節(jié)酶和細(xì)胞的固定化

（一）固定化酶的制備1、固定化酶（immobilizedenzyme）的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系。45什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)46

2、固定化酶的特點(diǎn)（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。（3）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。47化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)（一）傳統(tǒng)的酶固定化方法4849（1）載體結(jié)合法：將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法。A.物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃,樹脂等優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，有可能固定化和純化過程同時實(shí)現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。缺點(diǎn)：最適吸附酶量無規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系，酶與載體結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活下降并污染產(chǎn)物。50

B、離子結(jié)合法：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。DEAE-纖維素等優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。缺點(diǎn)：載體和酶的結(jié)合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響，離子強(qiáng)度高時，酶易脫落。51C、共價結(jié)合法：酶以共價鍵結(jié)合于載體上。即將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行共價結(jié)合的方法。優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。缺點(diǎn)：載體要活化，反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件劇烈，酶易失活和產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。52（2）交聯(lián)法：用雙功能或多功能試劑使酶與酶或細(xì)胞與細(xì)胞之間交聯(lián)的方法。交聯(lián)法又分：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法和載體交聯(lián)法。常用的交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。53酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶54（3）包埋法：A、網(wǎng)格型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏樹脂。天然高分子化合物有淀粉、明膠、膠原、海藻膠、角叉菜膠。多用于固定化細(xì)胞55B、微囊型：將酶或細(xì)胞包埋在高分子半透膜中。通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體。顆粒比網(wǎng)格型要小得多，比較有利于底物與產(chǎn)物的擴(kuò)散，但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。5657（二）新型的酶固定化方法溫和的條件下進(jìn)行，減少酶活力損失，提高固定化效率光偶聯(lián)法：光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團(tuán)的載體共價固定化酶等離子體法：高度激發(fā)的原子、分子，自由基的聚集體，載體表面用等離子體修飾，引入活性基團(tuán)偶合固定法：幾種固定化方法或載體的聯(lián)合應(yīng)用58無載體固定化酶直接用交聯(lián)劑交聯(lián)用交聯(lián)劑交聯(lián)溶解酶、晶體酶、物理聚集酶、和噴霧干燥酶等四種無載體酶體系，優(yōu)點(diǎn)如下：

1.催化活性高，成本低

2.具備較高的催化劑比表面

3.可加入多種酶

4.底物擴(kuò)散受限制少

5.極端條件下穩(wěn)定性高59（三）固定化細(xì)胞的方法1.固定化細(xì)胞的定義將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法.第二代固定化酶.

不用載體，通過化學(xué)或物理的手段使細(xì)胞彼此附著相連另外還有載體粘合，金屬螯合等多種方法602、固定化細(xì)胞的制備技術(shù)

（1）載體結(jié)合法制備技術(shù)：將細(xì)胞懸浮液直接與水不溶性載體相結(jié)合。載體主要為陰離子交換樹脂、陰離子交換纖維素、聚氯乙烯。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，符合細(xì)胞的生理?xiàng)l件，不影響細(xì)胞的生長及酶活性。缺點(diǎn)：吸附容量小結(jié)合強(qiáng)度低。（2）包埋法制備技術(shù)：與包埋酶法相同。61（3）交聯(lián)法制備技術(shù)：由于所用交聯(lián)劑戊二醛等對細(xì)胞有毒性，一般很少用。（4）無載體法制備技術(shù)：靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技術(shù)。通過助凝劑或選擇性熱變性的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化。此外還有粘合法，截留法等62（四）常用的固定化酶載體材料1.固定化酶載體材料的性質(zhì)要求(1)功能基團(tuán)(2)滲透性和比表面：大的比表面和多孔結(jié)構(gòu)(3)溶解性：要求不溶于水(4)機(jī)械剛性和穩(wěn)定性：(5)組成和粒徑：孔徑小(6)對微生物的抵抗性(7)經(jīng)濟(jì)環(huán)保632.固定化酶載體材料(1)高分子載體1)天然高分子材料：優(yōu)點(diǎn)：無毒，傳質(zhì)性好缺點(diǎn)：易被微生物降解一般用殼聚糖，海藻酸鈉641)合成有機(jī)高分子材料：強(qiáng)度大，抗微生物降解聚苯乙烯65(2)無機(jī)載體穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度高，不易降解，耐酸，成本低，壽命長玻璃，硅凝膠，鋁等66（3）復(fù)合載體：無機(jī)有機(jī)材料復(fù)合組成的新型載體磁性高分子微球:內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細(xì)粉末。回收簡單（4）新型載體：如光敏67

3、固定化方法的選擇（1）固定化酶應(yīng)用的安全性：要按照藥物和食品領(lǐng)域的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)作必要的檢查。所用試劑是否有毒性和殘留。盡可能選擇無毒性試劑。（2）固定化酶在操作中的穩(wěn)定性：在選擇固定化方法時要求固定化酶在操作過程中十分穩(wěn)定，能長期反復(fù)使用，在經(jīng)濟(jì)上有極強(qiáng)的競爭力。（3）固定化的成本：包括酶、載體、試劑的費(fèi)用，也包括水、電、氣、設(shè)備和勞務(wù)投資等。684、載體的選擇

為了工業(yè)化應(yīng)用，最好選擇工業(yè)化生產(chǎn)中已大量應(yīng)用的廉價材料為載體，如聚乙烯醇、卡拉膠、海藻膠等。離子交換樹脂、金屬氧化物及不銹鋼碎屑等都是有應(yīng)用前途的載體。此外，載體的選擇要考慮底物的性質(zhì)，如當(dāng)?shù)孜餅榇蠓肿訒r，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不銹鋼屑或陶瓷材料制備固定化酶，以便實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)和回收固定化酶。69二、固定化酶（細(xì)胞）的性質(zhì)與指標(biāo)

1、固定化酶的形狀（1）顆粒狀：包括酶珠、酶塊、酶片、酶粉。每種固定化方法均可制備顆粒狀，方法簡單，比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，適用各種反應(yīng)器。如酵母酶珠。（2）纖維狀：三醋酸纖維素用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂笈c酶混合，再用噴絲的方法就可制成酶纖維。比表面積大，轉(zhuǎn)化效率高，但只適用于填充床反應(yīng)器。此外，纖維酶可以織成酶布用于填充床反應(yīng)器。70（3）膜狀固定化酶：可通過共價結(jié)合的方法將酶偶聯(lián)在濾膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面積大，滲透阻力小，可用于酶電極，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管狀固定化酶：又稱酶管，利用管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，經(jīng)活化后與酶偶聯(lián)得酶管。酶管的機(jī)械強(qiáng)度大，切短后可用于填充床反應(yīng)器，也可組裝成列管式反應(yīng)器。目前已制備出糖化酶、轉(zhuǎn)化酶、脲酶等酶管。712、固定化酶的性質(zhì)

（1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或酶與底物結(jié)合時存在空間位阻效應(yīng)。包埋法中還有底物與產(chǎn)物擴(kuò)散阻力增大。（2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。其原因是限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶構(gòu)型的牢固程度。721.熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應(yīng)溫度和反應(yīng)速度，提高效率。2.對有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高3.PH，蛋白酶等穩(wěn)定性提高73A、操作穩(wěn)定性：通常半衰期達(dá)到1個月以上時，即具有工業(yè)應(yīng)用價值。B、貯藏穩(wěn)定性：一般不能長期貯存，現(xiàn)做現(xiàn)用，否則活力逐漸下降。若需長期保存，可在貯存液中添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑，并于低溫保存。C、對蛋白酶的穩(wěn)定性：大多數(shù)天然酶經(jīng)固定化后對蛋白酶的耐受力有所提高?？赡艿脑蚴怯捎诳臻g位阻效應(yīng)使蛋白酶不能進(jìn)入固定化酶內(nèi)部。74（3）酶學(xué)特性的變化

A、底物專一性：對底物的專一性下降。

B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變?。籶H-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。

C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

D、米氏常數(shù)(Km)：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。

E、最大反應(yīng)速度（Vm）：變化很小或不變。75(4)評價固定化酶（細(xì)胞）的指標(biāo)1.固定化酶活力測定單位;每毫克干重每分鐘轉(zhuǎn)化底物的量活力回收率=固定化酶總活力/加入酶的總活力相對活力＝固定化酶總活力/（加入酶的總活力－上清液中未偶聯(lián)的酶活力）2.偶聯(lián)率及相對活力的測定偶聯(lián)率＝（加入酶活力－上清液酶活力）/加入蛋白活力763.半衰期，即酶的活力降為初活力一半時所經(jīng)歷的連續(xù)操作時間。T1/2表示4.熱穩(wěn)定性：將固定化酶在不同溫度下溫育1h，在最適溫度下測酶活力，一般保持在60%以上77三、酶傳感器（一）原理它將活性物質(zhì)酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機(jī)物或無機(jī)物反應(yīng),形成一種能被電極響應(yīng)的物質(zhì)。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結(jié)合在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶傳感器通常是通過檢測產(chǎn)物H2O2的濃度變化或氧的消耗量來檢測底物。787980用葡萄糖氧化酶電極測定血液、尿、發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；用脲酶電極測定血液中的尿素濃度818283第四節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的反應(yīng)器用于酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶催化反應(yīng)過程示意圖過程調(diào)控生物反應(yīng)器

消毒原料預(yù)處理

產(chǎn)物分離提純

產(chǎn)品生物催化劑制備空氣除菌能量熱量84常見的酶反應(yīng)器類型按結(jié)構(gòu)區(qū)分?jǐn)嚢韫奘椒磻?yīng)器（StirredTankReactor,STR）鼓泡式反應(yīng)器(bubblecolumnreactor,BCR)填充床式反應(yīng)器(packedcolumnreactor,PCR)流化床式反應(yīng)器(FluidizedBedReactor,FBR)膜反應(yīng)器(MembraneReactor,MR)按操作方式區(qū)分分批式反應(yīng)(batch)連續(xù)式反應(yīng)(continuous)流加分批式反應(yīng)(feedingbatch)混合形式連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）分批攪拌罐反應(yīng)器（BatchStirredTankReactor,BSTR）85一、反應(yīng)器的類型和特點(diǎn)⒈間歇式攪拌罐反應(yīng)器用于游離酶反應(yīng)后隨即放料。又稱為批量反應(yīng)器（BatchReactorBSTR）。特點(diǎn)：底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶（細(xì)胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。

86優(yōu)點(diǎn)：裝置較簡單，造價較低缺點(diǎn)：固定化酶經(jīng)反復(fù)回收使用時，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反應(yīng)器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。87⒉連續(xù)流動攪拌罐反應(yīng)器連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（CSTR）。向反應(yīng)器投入固定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應(yīng)達(dá)到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流入底物溶液，同時，以相同流速輸出反應(yīng)液（含產(chǎn)物）。底物溶液進(jìn)口

反應(yīng)液出口

88優(yōu)點(diǎn)：混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。缺點(diǎn)：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。893.鼓泡式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器(bubblecolumnreactor,BCR)用于游離酶和固定化酶的催化反應(yīng)。在使用鼓泡式反應(yīng)器進(jìn)行固定化酶的催化反應(yīng)時，反應(yīng)系統(tǒng)中存在固、液、氣三相，又稱為三相流化床式反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡單，操作容易,剪切力小，物質(zhì)與熱量的傳遞效率高，是有氣體參與的酶催化反應(yīng)中常用的一種反應(yīng)器。例如氧化酶催化反應(yīng)需要供給氧氣，羧化酶的催化反應(yīng)需要供給二氧化碳等。

904.噴射式反應(yīng)器利用高壓蒸汽的噴射作用，實(shí)現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時催化的反應(yīng)器噴射罐和維持罐組成一般用于耐高溫酶的催化915.膜反應(yīng)器膜反應(yīng)器（membranereactor,MR）是將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器?？梢杂糜谟坞x酶的催化反應(yīng)，也可以用于固定化酶的催化反應(yīng)。用于固定化酶催化反應(yīng)的膜反應(yīng)器是將酶固定在具有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反應(yīng)器。膜反應(yīng)器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多種形狀。常用的是中空纖維反應(yīng)器。9293連續(xù)攪拌罐—超濾膜反應(yīng)器

簡稱CSTR-UFR。在CSTR（連續(xù)式攪拌罐）出口處設(shè)置一個超濾器?？梢詫⑿》肿赢a(chǎn)物與大分子酶和底物分開，有利于產(chǎn)物回收。該反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。游離酶在膜反應(yīng)器中進(jìn)行催化反應(yīng)時，底物溶液連續(xù)地進(jìn)入反應(yīng)器，酶在反應(yīng)容器的溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)后，酶與反應(yīng)產(chǎn)物一起，進(jìn)入膜分離器進(jìn)行分離，小分子的產(chǎn)物透過超濾膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循環(huán)使用。946.填充床反應(yīng)器（PackedReactor,PBR）

填充床反應(yīng)器。固定化酶添充于床層內(nèi)。反應(yīng)器內(nèi)的流體的流動形態(tài)為平推流形。底物以恒定流速通過反應(yīng)床.95優(yōu)點(diǎn)是：高效率、易操作、結(jié)構(gòu)簡單等，是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反應(yīng)器。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。缺點(diǎn)是：傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當(dāng)?shù)孜锶芏群腆w顆?；蝠ざ群艽髸r，不宜采用PBR96特點(diǎn)：底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài),達(dá)到混合的目的。7.流化床反應(yīng)器（FluidizedBedReactor,

FBR）97其流動方式使反應(yīng)液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用于處理黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反應(yīng)（即固、液、氣三相反應(yīng)）。但因FBR混合均勻，故不適用于有產(chǎn)物抑制的酶反應(yīng)。98各種反應(yīng)器的示意圖99各種酶反應(yīng)器的特點(diǎn)反應(yīng)器類型適用的操作方式適用的酶特點(diǎn)攪拌罐式反應(yīng)器分批式,流加分批式連續(xù)式,游離酶固定化酶反應(yīng)比較完全，反應(yīng)條件容易調(diào)節(jié)控制。填充床式反應(yīng)器連續(xù)式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應(yīng)的速度。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。流化床反應(yīng)器分批式流加分批式連續(xù)式固定化酶流化床反應(yīng)器具有混