葉綠素分解代謝中葉綠素酶作為限速酶進(jìn)行翻譯后調(diào)節(jié)

ThePlantCell,Vol.19:1007-022,March2007,a2007AmericanSocietyofPlantBiologistsChlorophyllaseIsaRate-LimitingEnzymeinChlorophyllCatabolismandIsPosttranslationallyRegulatedSmadarHarpaz-Saad,a,bTamarAzoulay,a,bTzahiArazi,aEranBen-Yaakov,a,bAnahitMett,aYoelM.Shiboleth,cStefanHo"rtensteiner,dDavidGidoni,aAmitGal-On,cEliezerE.Goldschmidt,bandYoramEyala,1葉綠素酶是葉綠素分解代謝中的限速酶并受翻譯后調(diào)節(jié)葉綠素在光合作用中捕獲光能起到了重要的作用，但是葉綠素分解代謝中的限速步驟和分解代謝中酶的調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。為了研究葉綠素酶(chlase)——葉綠素分解代謝途徑中第一個(gè)酶一一的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制，我們?cè)趦蓚€(gè)不同的植株系統(tǒng)中表達(dá)了柑橘(Citrussinensis)葉綠素酶的兩個(gè)不同類型：前體葉綠素酶和成熟葉綠素酶：(1)南瓜(Cucurbitapepo)植株使用的是病毒載體表達(dá)系統(tǒng)；(2)短暫轉(zhuǎn)化煙草(Mcotianatabacum)原生質(zhì)體。全長柑橘葉綠素酶的表達(dá)在原生質(zhì)體中導(dǎo)致了非常有限的葉綠素分解，在整株植株中沒有觀察到葉片不同的表型；而表達(dá)缺乏N端21個(gè)氨基酸的葉綠素酶(ChlaseA),類似于成熟蛋白，導(dǎo)致了在煙草原生質(zhì)體和南瓜葉片中大量的葉綠素分解。在低光照下生長的表達(dá)ChlaseA的南瓜葉片呈現(xiàn)出顯著的黃萎病表型，而在自然光下生長的此類南瓜葉片出現(xiàn)了擬光損傷表型，證明了葉綠素酸酯的積累，光中毒葉綠素分解產(chǎn)物。全長和成熟類型的柑橘葉綠素酶定位于表達(dá)的煙草原生質(zhì)體葉綠體膜組份上，并在此處對(duì)N端21個(gè)氨基酸的加工。在兩個(gè)植株系統(tǒng)我們都證實(shí)了葉綠素酶在葉綠素分解代謝中作為限速酶，并且受翻譯后調(diào)節(jié)。刖言葉綠素分子在光合作用中收集光能起到了重要的作用。它作為多聚蛋白色素光合復(fù)合物的一部份發(fā)揮其功能，葉綠素捕獲一個(gè)光子是轉(zhuǎn)換光能成為化學(xué)能再儲(chǔ)存為碳同化物的第一步。因?yàn)槿~綠素的生物合成和分解始終貫穿植株發(fā)育，這兩條途徑都受到可嚴(yán)重?fù)p害植株組織的中間代謝組分的影響。但是，對(duì)于植株組織中葉綠素分解代謝調(diào)節(jié)的研究還不深入；特別是對(duì)于葉綠素分級(jí)代謝中酶的調(diào)節(jié)機(jī)制還相當(dāng)不清楚(KrautlerandMatile,1999;Hortensteiner,2006)。葉綠素分解代謝主要發(fā)生在葉片衰老和果實(shí)成熟期，但在自然周期內(nèi)也以基礎(chǔ)水平進(jìn)行(Goldschmidt,2001)，受到環(huán)境條件影響導(dǎo)致光抑制，例如高光照(Prasiletal.,1992;AnderssonandBarber,1996)。在對(duì)植株組織中葉綠素分解產(chǎn)物的鑒定和描述后，葉綠素分解代謝途徑的研究最近取得了巨大的進(jìn)展(Amir-Shapiraetal.,1987;Engeletal.,1991;Matileetal.,1996;Hortensteiner,1999)。葉綠素分解成為葉綠醇，鎂和卟啉環(huán)初級(jí)剪切產(chǎn)物是由葉綠素酶(Chlase)，Mg去螯合酶，脫鎂葉綠素酸酯加氧酶和紅葉綠素分解代謝還原酶催化的連續(xù)四個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)的(圖1)。失去葉綠素典型的綠色僅僅發(fā)生在脫鎂葉綠素酸酯加氧酶催化的卟啉環(huán)剪切后。接下來的步驟，卟啉環(huán)分解產(chǎn)物被加工運(yùn)輸?shù)揭号葜?，可能它們被?chǔ)存那里(Hortensteiner,1999,2004;Matileetal.,1999;Takamiyaetal.,2000)。因此，葉綠素分解是一個(gè)多步的酶催化過程，并且這里面包括的主要的酶在幾年前已經(jīng)被分離出來(Terpstra,1981;Trebitshetal.,1993;Rodonietal.,1997;Tsuchiyaetal.,1997;Hortensteineretal.,1998),這些酶的基因遲遲未被克隆出來成為了研究葉綠素分解代謝的主要障礙(Takamiyaetal.,2000)。近幾年分解代謝途徑中關(guān)鍵酶基因得以分離(葉綠素酶[Jacob-Wilketal.,1999;Tsuchiyaetal.,1999];紅葉綠素分解代謝還原酶[Wuthrichetal.,2000];脫鎂葉綠素酸酯加氧酶[Pruinskaetal.,2003])為深入研究這些酶在葉綠素分解中的作用和調(diào)節(jié)作用提供了一個(gè)重要的工具。編碼葉綠素酶的第一個(gè)基因是基于蛋白質(zhì)序列資料(Jacob-Wilketal.,1999;Tsuchiyaetal.,1999)從柑橘(Citrussinensis)和藜屬(Chenopodium)植物中分離出來的，并在成熟蛋白上發(fā)現(xiàn)了N端編碼序列的缺失。就兩方面來說，這噪端的序列很短(在柑橘中僅有21個(gè)氨基酸，而在藜屬(Chenopodium)植物中僅有30個(gè)氨基酸)，并且這些N端序列沒有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的特點(diǎn)(藜屬(Chenopodium)植物的序列更接近于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽[Takamiyaetal.,2000])，有研究懷疑是否所有的葉綠素酶都定位于葉綠體，進(jìn)一步質(zhì)疑是否有些葉綠素分解代謝在葉綠素整個(gè)分子輸出后可以發(fā)生在液泡內(nèi)(Tsuchiyaetal.,1999;Takamiyaetal.,2000)。柑橘中編碼葉綠素酶的基因(Jacob-Wilketal.,1999)是唯一一個(gè)建立在葉綠體中分離純化的酶克隆出來的基因。因此，盡管包含短的(21個(gè)氨基酸)和非特異的N端序列，theexperimentalevidenceplacestheencodedproteinwithinthechloroplast(Trebitshetal.,1993;Jacob-Wilketal.,1999)。葉綠素分解代謝的調(diào)節(jié)和分解代謝中酶的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究比較困難，并且存在大量爭議。葉綠素酶，分解代謝途徑中的第一個(gè)酶，看起來非常有可能是此途徑中的限速酶(Tsuchiyaetal.,1999)。實(shí)際上，一些資料也支持這個(gè)觀點(diǎn)，例如脫綠和葉綠素酶在乙烯處理的柑橘中誘導(dǎo)表達(dá)(Jacob-wilketal.,1999)。但是，也有其他文獻(xiàn)不同意葉綠素酶在翻譯水平上作為限速酶進(jìn)行調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)。(1)葉綠素酶在柑橘果實(shí)正常發(fā)育的整個(gè)過程中始終保持較低的組成型表達(dá)，并且對(duì)于葉綠素分解產(chǎn)物與衰老和果實(shí)成熟的關(guān)系還不清楚(Jacob-Wilketal.,1999)。(2)植株組織中葉綠素酶的活性，與體外分析一樣，并不總是與自然衰老和果實(shí)成熟過程中的脫綠相關(guān)(Minguez-MosqueraandGallardo-Guerrero,1996;Fangetal.,1998)。(3)葉綠素酶被定位于葉綠體膜的內(nèi)層(Brandisetal.,1996;Matileetal.,1997)，對(duì)于葉綠素酶與其葉綠素底物如何接觸還不清楚。因此，對(duì)于葉綠素分解代謝中葉綠素酶在自然周期、衰老和脫綠過程中起到的調(diào)節(jié)作用和職責(zé)，綜合這些資料我們可以看到兩條主要的可能路線。一是葉綠素是組成型表達(dá)的，在葉綠素分解代謝中不受調(diào)節(jié)。另外，資料同樣支持葉綠素酶是限速步驟，并且在翻譯后調(diào)節(jié)。最近BenedettiandArruda(2002)和Kariolaetal.(2005)的研究表明，在擬南芥中過量表達(dá)葉綠素酶編碼基因影響了葉片組織中葉綠素：葉綠素酸酯的比率，但是沒有獲得可觀察的表型。這些結(jié)果提供了擬南芥葉綠素酶基因產(chǎn)物在體外具備活性但是沒有在葉綠素酶調(diào)節(jié)中分流光，以及它在葉綠素分解代謝中的作用的實(shí)證。圍繞葉綠素酶在葉綠素分解代謝中職責(zé)和調(diào)節(jié)作用的問題，我們開始在整株植物水平和細(xì)胞水平表達(dá)不同類型的葉綠素酶基因進(jìn)行生理學(xué)研究。我們得到的結(jié)果顯示，過量表達(dá)缺乏N端21個(gè)氨基酸的葉綠素酶類型，也就是成熟蛋白，導(dǎo)致了大量的葉綠素分解和萎黃化，說明它通過非常規(guī)的機(jī)制進(jìn)入了葉綠體，并且缺乏全長蛋白的調(diào)節(jié)抑制。在原生質(zhì)體中表達(dá)的全長和成熟柑橘葉綠素酶定位于葉綠素膜，并在那里進(jìn)行對(duì)N端21個(gè)氨基酸的加工。我們認(rèn)為，葉綠素在葉綠素分解代謝中起到限速酶的作用，并且受到翻譯后調(diào)節(jié)的控制。GreencolftfFigure1.ChlorophyllCatabolicPathway.結(jié)果Ser-147對(duì)于柑橘葉綠素酶的活性是必須的我們使用motifdetection軟件對(duì)Chlas基因的功能特征進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)了被公認(rèn)為是Ser脂肪酶結(jié)構(gòu)域(Jacob-Wilketal.,1999;Tsuchiyaetal.,1999;Takamiyaetal.,2000)。此Ser脂肪酸結(jié)構(gòu)域組成了Ser脂肪酸催化位點(diǎn)的核心，包括了一個(gè)完整、保守、必須的Ser殘基(Bradyetal.,1990;Winkleretal.,1990;Blow,1991;Lowe,1992)。最近，Tsuchiya等人(2003)的研究表明，Chenopodiumalbum(灰菜)的葉綠素酶中相應(yīng)的Ser殘基對(duì)于酶在體內(nèi)發(fā)揮功能是必須的，為Ser脂肪酸結(jié)構(gòu)域在葉綠素酶催化活性中的作用提供了試驗(yàn)上的支持。我們?cè)诟涕偃~綠素酶基因中相應(yīng)的Ser殘基(密碼子147)上誘導(dǎo)了Ser到Thr的突變，并且對(duì)此重組酶在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)的功能進(jìn)行分析，以在其他種屬間的葉綠素酶建立普通適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，并且開發(fā)和建立植株試驗(yàn)的負(fù)對(duì)照工具。野生型和S147T突變型的柑橘葉綠素酶都在大腸桿菌中以成熟形式(ChlaseAN，缺少cDNA編碼的前21個(gè)氨基酸)表達(dá)，也就是帶有硫氧還蛋白的融合蛋白，據(jù)報(bào)道重組的硫氧還蛋白融合蛋白具有較好的溶解性、穩(wěn)定性和功能(Holmgren,1985;LaVallieetal.,1992)。如前所述，可溶蛋白萃取物用以分析葉綠素酶體外的活性(Jacob-Wilketal.,1999)。結(jié)果顯示，野生型重組酶(pTrx-ChlaseAN)具備活性，而S147T突變完全失去了葉綠素酶體外活性(圖2A)。在S147T重組突變內(nèi)或者硫氧還蛋白(pTrx)對(duì)照內(nèi)都沒有發(fā)現(xiàn)葉綠素酸酯的積累。相應(yīng)樣品中可溶的硫氧還蛋白一葉綠素酶融合蛋白表達(dá)和硫氧還蛋白對(duì)照(pTrxcontrol)的一致性用硫氧還蛋白的單克隆抗體進(jìn)行蛋白凝膠斑點(diǎn)分析得出(圖2B)。C'nnt[IJrxpC'nnt[IJrxplYx-pin-ChmwhNChUseANSJ47TAEE卜捋ImaoueqJcUJqEFigure2.InVitroEnzymeActivityofRecombinantChlaseVersions.通過病毒載體系統(tǒng)在南瓜內(nèi)過量表達(dá)柑橘葉綠素酶我們通過設(shè)計(jì)ZYMV-based病毒載體侵染克隆系統(tǒng)（AGII）在南瓜內(nèi)表達(dá)我們感興趣的基因，來分析Chlase基因表達(dá)產(chǎn)物在植株體內(nèi)的功能（Arazietal.,2001,2002;Shoreshetal.,2006）。病毒基因（包括感興趣的基因）被翻譯成多聚蛋白然后水解成合適大小的相等的病毒蛋白。兩種類型的柑橘Chlase基因被克隆進(jìn)入AGII病毒載體多聚連接序列，位于Nib和coat蛋白基因之間（圖3A）：（1）全長葉綠素酶由完整的cDNA序列編碼組成（AGII-Chlase）；（2）相應(yīng)的成熟蛋白類型（蛋白序列決定的［Trebitshetal.,1993］），缺少由cDNA編碼的前21個(gè)氨基酸（AGII-ChlaseAN）0多聚連接體與NIa蛋白水解位點(diǎn)相連，以保證感興趣的外源基因產(chǎn)物將會(huì)被NIa蛋白水解酶催化的蛋白剪切從多聚蛋白上釋放出來（Arazietal.,2001）。設(shè)計(jì)的兩個(gè)克隆的N端都在植株體內(nèi)被加工成它們精確的原始序列，但是在:端保留了另外的6個(gè)氨基酸（加工過后），保證NIa蛋白酶的識(shí)別。這個(gè)附加的。端序列確保在兩個(gè)克隆上都有，應(yīng)該對(duì)它們的影響是一致的。我們分別用帶有侵染力的AGII-Chlase克隆和AGII-ChlaseAN克隆顆粒轟擊南瓜（CucurbitapepocvMa’ayan）子葉，以測(cè)試使用病毒系統(tǒng)在植株內(nèi)不同類型Chlase基因的表達(dá)情況。取下每個(gè)侵染植株的第三片真葉，在接種后8和21小時(shí)AGII基因組中Chlase基因的穩(wěn)定性用RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行測(cè)試（圖3B）。試驗(yàn)獲得了相應(yīng)大小的RT-PCR產(chǎn)物：AGII病毒載體對(duì)照（476bp），AGII-Chlase（1463bp），以及AGII-ChlaseAN（1400bp）。Chlase...DTVMLQ/MAA—VDTVMLQ，，ChlascAN-...DTVMLQ/ATL……VKIOTVMLQ/S.L.Figure3..ConstructionandExpressionofaViralVectorContainingtheCitrusChtaselGene.低光照下培養(yǎng)的南瓜中過量表達(dá)ChlaseAN導(dǎo)致萎黃表型對(duì)柑橘葉綠素酶在南瓜植株中過量表達(dá)產(chǎn)生的生理學(xué)效應(yīng)的研究通過用各Chlas類型的AGII病毒載體接種南瓜子葉來實(shí)現(xiàn)。接種后，將植株培養(yǎng)在溫室中持續(xù)低光照15RE）環(huán)境下10天，監(jiān)控第三片真葉（接種10天后完全展開）以觀察表型。此試驗(yàn)每個(gè)組合至少有30個(gè)植株的重復(fù)，典型的植株可以間后圖。用空對(duì)照病毒載體（AGII）和編碼全長葉綠素酶的載體（AGII-Chlase）侵染的植株呈現(xiàn)正常的表型，并有非常輕微的病毒侵染的癥狀（圖IA）。相對(duì)的，用編碼成熟蛋白對(duì)應(yīng)的葉綠素酶載體（AGII-ChlaseAN）侵染的植株發(fā)展出了明顯的斑點(diǎn)和萎黃表型（圖4A）。盡管獲得了不同的表型，從表達(dá)兩種類型葉綠素酶（全長和ChlaseAN）植株葉片的萃取物中葉綠素酶在體外的活性也進(jìn)行了對(duì)比，測(cè)量出的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化植株內(nèi)的葉綠素酶活性是AGII對(duì)照和未接種植株的400倍以上（圖4B；數(shù)據(jù)未給出）。以AGII-Chlase侵染的植株的葉綠素酶活性較以AGII-ChlaseAN侵染的植株高25%左右，與觀察到的表型形成對(duì)比。ChlaseAN過量表達(dá)植株的萎黃化表型與植物體內(nèi)的葉綠素酶活性相關(guān)為了在ChlaseAN過量表達(dá)植株的萎黃化表型與葉綠素酶體內(nèi)活性間建立聯(lián)系，我們測(cè)試了在南瓜植株中表達(dá)柑橘ChlaseANS147T無活性突變體的生理學(xué)影響。侵染AGII-ChlaseAN的植株再次觀察到了萎黃化的葉片表型，而在表達(dá)S147T突變體（ChlaseANS147T）的植株上沒有觀察到特殊表型（圖4C）。病毒引起的重復(fù)和多聚蛋白翻譯用RT-PCR和ZYMVcoat蛋白抗體蛋白凝膠斑點(diǎn)進(jìn)行分析，以確認(rèn)兩種葉綠素酶類型的病毒載體都侵染了植株（數(shù)據(jù)未給出）。接下來對(duì)葉片發(fā)育期萎黃化表型的研究發(fā)現(xiàn)此表型具有明顯的動(dòng)力學(xué)模式。萎黃化表型在第三片真葉時(shí)期開始出現(xiàn)，在葉片發(fā)育成熟期間發(fā)展直到侵染后10天左右（圖5）。這10

天以后，此表型開始消失，最后葉片復(fù)綠。4GJl-ChhiieAGUACIl-Cha^ANAGII-ChlascAtrlt-CEiiL^ANA(Jl-＜：天以后，此表型開始消失，最后葉片復(fù)綠。4GJl-ChhiieAGUACIl-Cha^ANAGII-ChlascAtrlt-CEiiL^ANA(Jl-＜：hlaseA＞A＜；IJ-Chlascii\SU7TL&L-4君言ea號(hào)帽翌SVWJFigure5,Dynamics,oftheChloroticFJhenotypeinChlaseiN-ExpressingPlants.自然光照下培養(yǎng)的南瓜中過量表達(dá)Chlase削導(dǎo)致類光損傷表型過量表達(dá)全長葉綠素酶和ChlaseAN的生理學(xué)效應(yīng)用培養(yǎng)在溫室中暴露在自然光(~500rE)下的植株進(jìn)行測(cè)試。如前所述，此試驗(yàn)每個(gè)組合至少包括30株植株的重復(fù)，并且典型植株在一下圖片可見。雖然以AGII-Chlase或AGII對(duì)照侵染的植株再次沒有特殊的表型，但是以

AGII-ChlaseAN侵染的植株呈現(xiàn)出明顯的類光損傷表型（圖6A）。此可致死的損傷，類似前人報(bào)道的病原體導(dǎo)致的過敏性反應(yīng)（Dangletal.,1996），在葉片表面隨處可見（圖6A）。對(duì)葉片自然萃取物測(cè)試的葉綠素酶體外活性顯示，過量表達(dá)全長葉綠素酶或者ChlaseAN導(dǎo)致了葉綠素酶活性較AGII侵染對(duì)照高200倍（圖6B）。表達(dá)全長葉綠素酶的無特殊表型葉片的葉綠素酶體外活性幾乎是表達(dá)ChlaseAN呈現(xiàn)類光損傷表型的兩倍。過量表達(dá)Chlase削植株的類光損傷表型屬光依賴，且與葉綠素酶活性相關(guān)關(guān)于類光損傷表型和葉綠素酶活性間的聯(lián)系的研究，通過測(cè)試過量表達(dá)和分析暴露在自然光下的南瓜無活性的S147T突變植株實(shí)現(xiàn)。無活性的突變表達(dá)植株（AGII-ChlaseANS147T）沒有出現(xiàn)ChlaseAN表達(dá)植株（AGII-ChlaseAN）所呈現(xiàn)的類光損傷表型，說明在此表型和葉綠素酶活性間有直接的聯(lián)系（圖6C）。通過RT-PCR和使用ZYMVcoat蛋白抗體的蛋白凝膠斑點(diǎn)分析證實(shí)了兩類型的葉綠素酶病毒載體的病毒的積累以及多聚蛋白翻譯（數(shù)據(jù)未給出）。我們已經(jīng)知道導(dǎo)致類光損傷表型有很多原因（Molinaetal.,1999;MittlerandRizhsky,2000;Pruzinskaetal.,2007），包括葉綠素生物合成中的光氧化劑壓力和分解代謝突變（Huetal.,1998;Mocketal.,1999;Ishikawaetal.,2001;Pruzinskaetal.,2007），直接測(cè)試表達(dá)ChlaseAN植株類光損傷表型發(fā)展過程中包含的光很吸引人。以AGII-ChlaseAN侵染的植株培養(yǎng)在溫室中的自然光照條件下，每個(gè)處理第三片葉一半被遮去90%以上的光照。暴露的葉片部分發(fā)展出了類光損傷的特征表型，而遮光的部分幾乎沒有此表型（圖7A）?！簈」.**t￡〕&一>*。44>5些一AudoJa.u#B『q」.**t￡〕&一>*。44>5些一AudoJa.u#BAGHACIKhlascAGHthl雌MN前人研究表明，類光損傷表型可能是由于光中毒葉綠素合成或分解產(chǎn)物積累導(dǎo)致的氧化壓力產(chǎn)生的（Huetal.,1998;Mocketal.,1999;Ishikawaetal.,2001;Pruzinskaetal.,2003,2007）。因此，我們推測(cè)這種假設(shè)很有可能，表達(dá)ChlaseAN的南瓜植株產(chǎn)生的類光損傷表型是由葉綠素分解產(chǎn)物積累導(dǎo)致增強(qiáng)了葉綠素酶功能引起的，然后導(dǎo)致下游酶催化反應(yīng)的瓶頸。實(shí)際上，在類光損傷表型出現(xiàn)前的2到3天，在生長期的表達(dá)ChlaseAN的南瓜植株葉片出現(xiàn)了大量的葉綠素酸酯的積累（圖7B）。這些葉片中葉綠素酸酯a:葉綠素a的比率較表達(dá)全長葉綠素酶或者AGII病毒侵染或未侵染的葉片的比率搞大約90倍。而葉綠素酸酯b:葉綠素b的比率高了20倍。但是，在表達(dá)ChlaseAN植株中積累的葉綠素酸酯是短暫的，而且在光損傷表型出現(xiàn)后其程度劇減（數(shù)據(jù)未給出）。我們發(fā)現(xiàn)不可能給此次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行葉綠素酸酯級(jí)別的動(dòng)力學(xué)研究，因?yàn)橹仓觊g處于不同發(fā)育期的葉片（3葉）差別很大。但是，試驗(yàn)結(jié)果非常具有代表性，而且三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)都具備性質(zhì)上的可重復(fù)行。NaturalliightAShadedFigure7.TteL&sen-MinicPremtjpeCasjsedChfeLaeANIsLght-Depends?^NaturalliightAShadedFigure7.TteL&sen-MinicPremtjpeCasjsedChfeLaeANIsLght-Depends?^andFtesurtsfromIFeAcctrnulationofIIBreakcky"Product.Nnn才i防偵由Chlcwophyilfhexansphase)Chlorcphyllidfi(acetonephase)為了使得在南瓜植株中表達(dá)柑橘不同類型葉綠素酶產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)的研究更完善，我們也分析了在煙草（NicotianatabacU原生質(zhì)體中短暫表達(dá)柑橘葉綠素酶產(chǎn)生的影響（圖8）。因此，同樣的柑橘不同葉綠素酶類型（全長和ChlaseAN）以細(xì)胞水平在附加的植株系統(tǒng)中得以分析。設(shè)計(jì)的兩個(gè)質(zhì)粒包含由35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的編碼綠色熒光蛋白的基因（GFP），和全長Ch/ase（p35S-Chlase+35S-GFP）或Ch/aseAV（p35S-ChlaseAN+35S-GFP）分別由附加的35S啟動(dòng)子引導(dǎo)。另外還有一個(gè)對(duì)照質(zhì)粒僅由35S啟動(dòng)子引導(dǎo)的GFP編碼基因組成（p35S-GFP）。這三個(gè)質(zhì)粒通過electroporate進(jìn)入煙草原生質(zhì)體進(jìn)行短暫轉(zhuǎn)化，細(xì)胞熒光通過共焦顯微鏡記錄（圖8B）。轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞通過特異積聚在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的GFP熒光可以篩選出來。轉(zhuǎn)化細(xì)胞葉綠體中的葉綠素級(jí)別由葉綠素紅色自熒光進(jìn)行監(jiān)控。圖8B展示了用7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)總結(jié)的葉綠素酶體內(nèi)活性的半定量分析。通過紅色熒光測(cè)定這三個(gè)組合的葉綠素級(jí)別顯示典型的細(xì)胞呈現(xiàn)出相似的GFP熒光密度。只表達(dá)GFP的對(duì)照細(xì)胞的葉綠素級(jí)別通過測(cè)定得到葉綠素區(qū)域密度（chlorophyllareaintensity:CAI）=15.55±1.8。過量表達(dá)全長葉綠素酶細(xì)胞葉綠體中的葉綠素級(jí)別相對(duì)GFP對(duì)照呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（~23%;CAI=3.6±0.5），說明體內(nèi)有一些葉綠素分解活性的存在，但是所有的葉綠體仍舊保留有意義的葉綠素?cái)?shù)量（爵B）。過量表達(dá):hlaseAN的細(xì)胞呈現(xiàn)葉綠體缺乏葉綠素或者含有非常低水平的葉綠素（平均是野生型的4.5%；CAI=0.71±0.64），說明體內(nèi)的葉綠素分解活性得到增強(qiáng)。煙草原生質(zhì)體中表達(dá)的葉綠素酶和Chlase削都定位于葉綠體膜表達(dá)葉綠素酶和ChlaseAN兩種類型獲得的不同表型使得我們?nèi)パ芯克鼈儼麅?nèi)定位。起初的研究包括了可見的葉綠素酶-GFP和ChlaseAN-GFP融合體（N端、C端和內(nèi)部融合）在煙草原生質(zhì)體中短暫地表達(dá)。但是，表達(dá)不同類型I的GFP融合體的原生質(zhì)體都保持了正常的葉綠素級(jí)別，說明發(fā)生了不正確定位或者失活。因此，我們選擇另一條定位途徑包括免疫探測(cè)表達(dá)葉綠素酶或者ChlaseAN的原生質(zhì)體葉綠體組份上的葉綠素酶不同類型（圖8C,D）。煙草原生質(zhì)體中全長葉綠素酶表達(dá)最初以大約35KD的前體被發(fā)現(xiàn)，然后加工成為成熟形式的大約33KD，而ChlaseAN表達(dá)形成的是成熟形式（~33KD）（圖8C）。短暫轉(zhuǎn)化表達(dá)葉綠素酶或ChlaseAN72小時(shí)的煙草原生質(zhì)體用于接下來對(duì)定位的研究（圖8D）。柑橘葉綠素酶特異抗體免疫斑點(diǎn)顯示，全長和成熟葉綠素酶的可比級(jí)別呈現(xiàn)在Percoll梯度純化的完整葉綠體相對(duì)于原生質(zhì)體中，而蛋白載入建立在相等的葉綠素上（葉綠素的降低發(fā)生在葉綠素表達(dá)原生質(zhì)體中并不重要，因?yàn)樗鼈儍H僅組成了5%到10%的原生質(zhì)體組分）。相似地，完全的ZhlaseAN級(jí)別在葉綠體和原生質(zhì)體中被發(fā)現(xiàn)，說明兩種葉綠素酶類型都定位在葉綠體中。接下來的定位，通過冷凍/解凍循環(huán)（見方法）將完整的葉綠體裂解，以保證完整的葉綠體溶解并且通過超速離心法處理為可溶組份和膜組份。在表達(dá)全長的葉綠素原生質(zhì)體中，前體與成熟的葉綠素酶都能夠在葉綠體膜組份中找到，而在可溶組份中都沒有。用200mM的NaCl緩沖液萃取膜組份中的膜結(jié)合葉綠素酶蛋白并未成功（數(shù)據(jù)未給出），而用0.5%Tritonx-100緩沖液得到了這兩種類型的葉綠素酶。原生質(zhì)體中表達(dá)ChlaseAN得到了相似的結(jié)果，在膜組份中發(fā)現(xiàn)了ChlaseAN，而在可溶組份中沒有，而且用0.5%Tritonx-100緩沖液使得蛋白被釋放。用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白LHII（聚光復(fù)合物II）和OE33（氧離析復(fù)合物的33KD亞基）的抗體做探針探測(cè)膜以確認(rèn)可溶組份與膜組份的分餾產(chǎn)物。完整的膜蛋白LHII僅在膜組份中用0.5%Tritonx-100緩沖液發(fā)現(xiàn)；相應(yīng)的，在腔內(nèi)以游離態(tài)和結(jié)合到類囊體鑲嵌的光合系統(tǒng)II狀態(tài)的內(nèi)腔蛋白OE33（EttingerandTheg,1991）,，用先前我們導(dǎo)致內(nèi)囊提斷裂并釋放內(nèi)腔蛋白的方法，即猛烈的冰凍/解凍循環(huán)，在膜組份和可溶組份中都可以找到（Hinchaetal.,1987;Grounevaetal.,2006）.。討論本研究中，我們?cè)趦蓚€(gè)不同的植物中用兩個(gè)完全不同的表達(dá)系統(tǒng)，來研究葉綠素酶在葉綠素分解代謝中的作用及其調(diào)節(jié)這一關(guān)鍵問題。雖然EST數(shù)據(jù)說明大多數(shù)植物都有不止一個(gè)的葉綠素酶同源體，但是我們選擇了柑橘Chlasel基因（Jacob-Wilketal.,1999）來進(jìn)行這項(xiàng)研究，因?yàn)椋?）這是唯一一個(gè)在試驗(yàn)上證明了編碼定位于葉綠體膜上酶的葉綠素酶基因（Trebitshetal.,1993;Jacob-Wilketal.,1999）；（2）這是僅有的兩個(gè)成熟蛋白加工位點(diǎn)在試驗(yàn)上得以確定的葉綠素酶之一（Jacob-Wilketal.,1999;Tsuchiyaetal.,1999）。柑橘Chlasel基因在兩個(gè)系統(tǒng)中過量表達(dá)：（1）ZYMV-based病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，有效地在南瓜植株中表達(dá)了兩種葉綠素酶至少21天，為研究葉綠素酶在植物中表達(dá)的生理學(xué)效應(yīng)提供了充足的時(shí)間；(2)在煙草細(xì)胞中的短暫表達(dá)系統(tǒng)，得以在細(xì)胞水平觀察柑橘葉綠素酶表達(dá)的生理學(xué)效應(yīng)。在兩個(gè)系統(tǒng)中的試驗(yàn)結(jié)果都肯定與支持了我們以下的主要結(jié)論。我們得到的結(jié)果中最能激起興趣的可能是ChlaseAN的表達(dá)，也就是相應(yīng)的成熟柑橘葉綠素酶，導(dǎo)致了原生質(zhì)體與低光照下生長植株明顯的萎黃化，而全長酶的表達(dá)僅導(dǎo)致了普通的葉綠素分解。ChlaseAN明顯失去了正常的調(diào)節(jié)功能，讓我們想到了其他由于以下兩個(gè)原因而被活化的酶：(1)缺失調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(例如：Glu脫羧酶缺失了鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域[Baumetal.,1996])；或者(2)缺失負(fù)責(zé)胞內(nèi)酶定位的結(jié)構(gòu)域(例如：HMGR缺失了膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域[Ayora-Talaveraetal.,2002])。因此，過量表達(dá)全長葉綠素酶獲得的普通表型說明，與全長HMGR和Glu脫羧酶類似，葉綠素酶是翻譯后調(diào)節(jié)的。在低光照下生長的表達(dá)過量ChlaseAN的植株表現(xiàn)了萎黃化，而在自然光下表達(dá)相同結(jié)構(gòu)的植株表現(xiàn)了類光損傷表型，可能是由于氧化壓力。我們證明了這個(gè)表型是由于光刺激導(dǎo)致光反應(yīng)葉綠素分解中間產(chǎn)物一一葉綠素酸酯短暫積累導(dǎo)致的。由光合作用器官外的葉綠素酸酯吸收的光能，轉(zhuǎn)化到單線態(tài)氧和氧自由基，引起了基因控制的程序化凋口Wagneretal.,2004)。在低光密度下，產(chǎn)生的脅迫和預(yù)期一樣地降低，成功的反應(yīng)了相應(yīng)酶的機(jī)制。實(shí)際上，在低光照環(huán)境下，除葉綠素分解外沒有其他任何損傷發(fā)生，并且萎黃化的葉片最終復(fù)綠(圖5)，大約發(fā)生病毒載體在全展開葉片中復(fù)制減少后，就像前人對(duì)馬鈴薯病毒的研究(Hull,2002)。光和類光損傷中光中毒導(dǎo)致的葉綠素分解中間產(chǎn)物的相關(guān)性在接下來的研究中被沒有表型的半避光葉片(圖7A)和已經(jīng)報(bào)道的葉綠素合成代謝或分解代謝突變植株發(fā)生的相似類光損傷表型事實(shí)證明(Huetal.,1998;Mocketal.,1999;Molinaetal.,1999;Ishikawaetal.,2001;Machetal.,2001;Pruzinskaetal.,2003)。這些結(jié)果走到同一個(gè)觀點(diǎn)，葉綠素分解代謝途徑是一個(gè)緊密控制、分解光中毒激活的色素必需的解毒過程(Vicentinietal.,1995;Matileetal.,1996;Ho"rtensteiner,2004;Yangetal.,2004)。本文中同樣簡要介紹了葉綠素酶分解途徑，并且重點(diǎn)介紹了葉綠素酶，其可能通過影響“損傷一生產(chǎn)”光中毒自由葉綠素級(jí)別來參與植物的防御響應(yīng)(Kariolaeyal.,2005)。大量主要的核編碼葉綠體蛋白通過包括N端信號(hào)肽的機(jī)制轉(zhuǎn)移到葉綠體中，通過剪切進(jìn)入到葉綠體中(reviewedinFuksandSchnell,1997)?；谶@個(gè)原因，對(duì)于柑橘和藜屬(Chenopodium)核編碼葉綠素酶成熟蛋白N端蛋白質(zhì)序列的測(cè)定發(fā)現(xiàn)這些蛋白分解受到了21位和30位的氨基酸加工(Trebitshetal.,1993;Jacob-Wilketal.,1999;Tsuchiyaetal.,1999)。但是，N端結(jié)構(gòu)域剪切的作用還是個(gè)迷，因?yàn)檫@段序列不符合我們知道的任何葉綠素信號(hào)肽的特點(diǎn)?；诂F(xiàn)在已有的數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為柑橘葉綠素酶N端21個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域不起典型的N端葉綠體引導(dǎo)信號(hào)肽的作用，因?yàn)槿L葉綠素酶和ChlaseAN都進(jìn)入了葉綠體并且催化了葉綠素的分解。這個(gè)觀點(diǎn)稍后被柑橘葉綠素酶N端結(jié)構(gòu)域沒有引導(dǎo)GFP融合蛋白進(jìn)入葉綠體的試驗(yàn)印證(數(shù)據(jù)未給出)。所以，看起來有另外一個(gè)不同的蛋白結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)葉綠素酶向葉綠體中輸送，如同其他葉綠體內(nèi)在囊膜蛋白(Mirasetal.,2002)。本文中另外一個(gè)值得一提的是，葉綠素酶可能是種糖蛋白(Terpstra,1981;Tsuchiyaetal.,1997,1999)；因此，它進(jìn)入葉綠體的通道可能更復(fù)雜，可能通過糖基化進(jìn)入，就像最近報(bào)道的碳脫水酶(Villarejoetal.,2005)。我們僅僅能在這一層面猜測(cè)，正常的調(diào)節(jié)葉綠素酶活性的機(jī)制是否知端21個(gè)氨基酸的加工有關(guān)，并引起了葉綠素的降解。對(duì)于ChlaseAN葉綠素分解活性增加可能的解釋是切除了包含在N端21個(gè)氨基酸中的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域?qū)е铝酥参矬w內(nèi)更高的酶活性。這個(gè)可能讓我們想起了調(diào)節(jié)Ser脂肪酶催化位點(diǎn)的N端振動(dòng)機(jī)制(Hermosoetal.,1996;Pignoletal.,2000)，盡管脂肪酸的振動(dòng)結(jié)構(gòu)域是由底物遮蓋起來的，并且不能被蛋白酶切除。另外一個(gè)可能是N端21個(gè)氨基酸直接或簡介參與了葉綠素酶區(qū)域化，N端的可切除給予了葉綠素酶直接接觸底物葉綠素酶的能力。這個(gè)可能性與定位蕓苔和大麥(Hordeumvulgare)葉綠素酶于葉綠體內(nèi)囊膜的研究觀點(diǎn)一致(Matileetal.,1997)。但是，這些試驗(yàn)中，僅有6%的總細(xì)胞葉綠素酶活性在囊片段上，可能是由于從葉綠體基質(zhì)和基粒中分離葉綠體內(nèi)囊膜技術(shù)上的困難。本文中需要提出的是，最近使用電子顯微鏡證明內(nèi)囊和基質(zhì)片層間有物理上的聯(lián)系(Shimonietal.,2005)。因此，葉綠素酶定位在質(zhì)體的內(nèi)囊膜上是確定的(同樣也在成色素細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由Hirschfeld和Goldschmidt［1983］和Brandis等［1996］報(bào)道)，但是基于這里的資料并沒有排除定位于葉綠體膜的其他位置。關(guān)于不同植株種類葉綠素酶定位一致的唯一結(jié)果是將葉綠素酶活性與葉綠體膜聯(lián)系起來(ArdaoandVennesland,1960;Terpstra,1974,1976;Tarasenkoetal.,1986;Trebitshetal.,1993;SchellenbergandMatile,1995)。為了進(jìn)一步搞清楚葉綠素酶定位和葉綠素酶翻譯后加工調(diào)節(jié)機(jī)制，我們通過在純化的葉綠體可溶和膜組份中表達(dá)可視的Chlase-GFP融合蛋白和免疫篩選兩種葉綠素酶的方法在我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中定位柑橘葉綠素酶。Chlase-GFP融合蛋白顯示是沒有價(jià)值的，可能是因?yàn)殄e(cuò)誤定位，對(duì)于使用GFP融合很常見(Tianetal.,2004)。葉綠體組份研究建立在Percoll梯度純化短暫表達(dá)的煙草原生質(zhì)體葉綠體上，全長葉綠素酶和成熟葉綠素酶都定位在葉綠體膜組份，在那里也進(jìn)行N端21個(gè)氨基酸的加工。介于葉綠素酶活性無論在幼嫩、衰老組織還是果實(shí)成熟組織都集中在膜組份(Trebitshetal.,1993),這個(gè)結(jié)果并不意外。雖然這些結(jié)果沒有解開葉綠素酶體內(nèi)活性受翻譯后調(diào)節(jié)的機(jī)制的問題，但是這過程的動(dòng)力學(xué)說明了全長酶加工到成熟形式可能是一個(gè)限速步驟。接下來的工作，可能使用電子顯微鏡，會(huì)回答是否不同的酶類型定位于葉綠體中不同的膜部位，是否N端的加工與選擇性的膜定位有關(guān)。本文中，我們注意到膜區(qū)隔和葉綠體膜加工之間空間的再布置已經(jīng)被證明是為了D1蛋白的透過(MattooandEdelman,1987)。葉綠素酶作為葉綠素分解代謝中限速酶的可能的作用已經(jīng)成為了爭論的焦點(diǎn)，現(xiàn)有資料沒有下結(jié)論。葉綠素酶基因的表達(dá)和體內(nèi)活性往往是組成型的，或者與自然的葉片衰老和果實(shí)成熟沒有聯(lián)系(Minguez-MosqueraandGallardo-Guerrero,1996;Fangetal.,1998;Jacob-Wilketal.,1999)，說明如果葉綠素酶不是葉綠素分解代謝中的限速酶就是葉綠素酶的功能受翻譯后調(diào)節(jié)，導(dǎo)致了功能上的遲緩(Matileetal.,1997,1999;Jacob-Wilketal.,1999)。本研究中，我們使用缺少調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的葉綠素酶類型卻導(dǎo)致了徹底的萎黃化，說明葉綠素分解代謝中葉綠素酶作為限速酶受翻譯后調(diào)控。因?yàn)槿~綠素的級(jí)別持續(xù)受到植物生命循環(huán)和分解途徑的調(diào)節(jié)，避免光中毒活性色素的積累，翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制(相對(duì)于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié))使得生理正?；?，使得植株對(duì)于環(huán)境刺激的反應(yīng)更加有效積極。這與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制并不矛盾；其實(shí)，在柑橘水果中，乙烯能導(dǎo)致葉綠素酶基因的轉(zhuǎn)錄(Jacob-Wilketal.,1999)。葉綠素酶與它的底物葉綠素接觸并起始葉綠素分解的機(jī)制已經(jīng)是一個(gè)有爭議的問題，有些文章中的觀點(diǎn)認(rèn)為可能葉綠素是朝著葉綠素酶移動(dòng)并分解的機(jī)制，這樣的葉綠素酶應(yīng)該定位于內(nèi)囊膜上(Matileetal.,1997;Hortensteiner,2006)。雖然我們現(xiàn)在沒有任何資料證實(shí)這樣的機(jī)制，我們的結(jié)果顯示ChlaseAN催化導(dǎo)致了嚴(yán)重的萎黃化，因此支持了葉綠素酶抵達(dá)富集葉綠素的光合作用復(fù)合物的機(jī)制，且不能相反，如前所述。我們的結(jié)果關(guān)于體內(nèi)和體外活性聯(lián)系的問題在前面提到的生理學(xué)研究中葉綠素酶作用的解釋建立在其體外活性上。在南瓜葉片中表達(dá)全長柑橘葉綠素酶和ChlaseAN導(dǎo)致了由體外分析得到的相似級(jí)別的葉綠素酶活性，但是極不同的表型。因此，結(jié)果說明對(duì)于體外葉綠素酶活性的結(jié)果必須有極大的關(guān)注。雖然體外的活性可以證明大概的組織內(nèi)葉綠素酶活性級(jí)別，數(shù)據(jù)說明它并不能證明酶在體內(nèi)真實(shí)的功能。這現(xiàn)象最可能的解釋是葉綠素酶功能受翻譯后調(diào)劑的觀點(diǎn);體外活性分析忽略了亞器官區(qū)隔化障礙的破壞或者直接對(duì)酶活性的影響導(dǎo)致的正常功能的調(diào)節(jié)作用(例如：緩沖成分和去垢劑組份影響酶的活性)。這重要的一課對(duì)于葉綠素酶功能和處于果實(shí)成熟和衰老發(fā)展期葉綠素分解調(diào)節(jié)間聯(lián)系的研究可能非常實(shí)用。相似地，葉綠素酶體外活性前人曾用做持綠突變?nèi)~綠素酶的研究(Akhtaretal.,1999)。今后的研究中，葉綠素酶翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制可能會(huì)對(duì)持綠突變中的葉綠素酶和衰老和果實(shí)成熟中葉綠素分解代謝過程的研究有促進(jìn)作用。ILCiuBSFaNT~?Chh-sep35S-Chl?5e+35S43FP■35kDILCiuBSFaNT~?Chh-sep35S-Chl?5e+35S43FP■35kD瞬kDLHCIIOE33p35S-ChlaEeAFJLHCli方法在細(xì)菌中表達(dá)重組的野生型和突變?nèi)~綠素酶包括了前21個(gè)氨基酸的葉綠素酶cDNA序列被克隆進(jìn)入硫氧還蛋白融合表達(dá)載體pTrxFus(Invitrogen)，如前所述(Jacob-Wilketal.,1999)。使用引物5’-GCTGTTATGGGGCACACCCGCGG-AGGACAAACG-3’進(jìn)行直接點(diǎn)突變產(chǎn)生葉綠素酶突變類型(Ser-1479Thr)。各類型葉綠素酶在大腸桿菌中作為硫氧還融合蛋白表達(dá)(Jacob-Wilketal.,1999)。可溶蛋白萃取物由10mL細(xì)菌細(xì)胞4000g10分鐘離心得到。顆粒在2mLgrindingbuffer中重懸(20mM鈉磷酸鹽，pH8,500mMNaCl,0.1%Tritonx-100)。加入1mg/mL的溶酶體，懸液在4°Cf孕育1小時(shí)后使用液氮開始三個(gè)冰凍/解凍循環(huán)。樣品在TC下15000g離心30分鐘，分離可溶和顆粒組份?？扇苋~綠素酶重組蛋白體外活性分析如前人結(jié)論進(jìn)行(Jacob-Wilketal.,1999)。建立病毒載體AGII-Chlase質(zhì)粒在南瓜中表達(dá)為了使得Chlase克隆進(jìn)入AGII病毒載體(Arazietal.,2001)，使用致變引物5’-GTGGACGCC-AAGCCGGCAGCTTCAGTGC-3’和5’-GCTACCCCAAGGCCTTCAGCAAAATCTCCCAG-3’在不改變編碼氨基酸的情況下通過直接點(diǎn)突變(Kunkeletal.,1987)去掉存在于原柑橘(Citrussinensis)葉綠素酶cDNA(位于76和426)的兩個(gè)PstI限制性位點(diǎn)。全長(990bp開放閱讀框)葉綠素酶基因序列的兩種類型(野生型和S147T突變型)使用包含PstI和SalI限制性位點(diǎn)的引物，以亞克隆進(jìn)入AGII病毒載體(5'-GAACTGCAGATGGCAGCAATGGTGGACG-3'和5’-GATGTCGACTACTTTT-ACATGTGTTGTGGTAAGCATGCTTGATGC-3’)。N端缺失(924bp開放閱讀框)的葉綠素酶基因序列的兩種類型(野生型和S147T突變型)使用包含PstI和SalI限制性位點(diǎn)的引物，以亞克隆進(jìn)入AGII病毒載體(5’-CATTATCTGCAGGCCACACTTCCGGTATTTAC-3和5’-GATGTCGACTACTTT-TACATGTGTTGTGGTAAGCATGCTTGATGC-3’)。引物的設(shè)計(jì)包含了NIa蛋白水解位點(diǎn)(Arazietal.,2001)和一個(gè)閱讀片段與AGII基因一致，在3’端沒有任何密碼停頓，使得葉綠素酶在植株體內(nèi)可以以病毒編碼的多聚蛋白表達(dá)并在隨后被NIa蛋白水解釋放。葉綠素酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)入pGEM-TEasy質(zhì)粒(Promega)，測(cè)序，然后亞克隆進(jìn)入AGII病毒載體。如前所述，陽性克隆被用于接種南瓜植株(Cucurbitapepo)。南瓜植株生長、接種、癥狀評(píng)估本試驗(yàn)中全部使用商業(yè)上的栽培方法(cvMa’ayan)培養(yǎng)南瓜種子，當(dāng)子葉全部展開時(shí)選擇幼苗進(jìn)行試驗(yàn)。使用手槍裝置(Gal-Onetal.,1997)顆粒轟擊以接種各個(gè)病毒載體。接種以后，南瓜種子種植在生長室中23°C下持續(xù)光照(~11rE)或者在溫室中自然光照下(巧00rE)。每天觀察癥狀發(fā)展，并對(duì)第一次出現(xiàn)癥狀進(jìn)行了記錄。通過Arazi等人(2001)的方法RT-PCR以確認(rèn)病毒在植株體內(nèi)蔓延。葉綠素酶體外活性分析用如前所述的方法(Jacob-Wilketal.,1999)分析南瓜葉片粗萃取物中葉綠素酶的活性，做了微小的改動(dòng)：沒有進(jìn)行在反應(yīng)液中的預(yù)培養(yǎng)，并且反應(yīng)緩沖液由0.05mL的萃取緩沖液混成(50mM磷酸鈉鹽，pH7.4，50mMKCl，5mMMgCl2，5mMDTT和1%TritonX-100)，0.45mL的反應(yīng)緩沖液A(50mM磷酸鈉鹽，pH7.4和50mMKCl)，以及2.5mL的反應(yīng)緩沖液B(50mM磷酸鈉鹽，pH7.4，50mMKCl和0.5%TritonX-100)。葉綠素酶a底物從歐芹(Petroselinumsativum)葉片中通過Bazzaz和Rebeiz(1978)的方法制備，在-20C環(huán)境下干燥保存，用前用丙酮重溶。南瓜葉片葉綠素：葉綠素酸酯比率的確定使用200mg的切碎葉片在6mL100%丙酮4C黑暗中處理72小時(shí)萃取葉綠素。每個(gè)樣品中4毫升溶液加到含有6mL己烷和1mLKOH(10mM)的透紫外線試管中。混合物混合均勻12000g離心2分鐘以獲得分離的不同相。葉綠素級(jí)別在丙酮相中確定，而葉綠素酸酯級(jí)別在己烷相中用分光光度法測(cè)得，使用Arnon(1949)的兩公式表示Chla(Rg/mL)=12.7xA663-2.69xA645和Chlb(Rg/mL)=22.9xA645-4.68xA663。植株、原生質(zhì)體、葉綠體和葉綠體組份中蛋白的萃取南瓜葉片組織樣品(150mg)在萃取緩沖液中均勻化，包含50mMTris-HCl，5%6-巰基乙醇，10%甘油和2%SDS，pH6.8，煮沸變性5分鐘。萃取物以21000g離心10分鐘，浮在表面的轉(zhuǎn)移到新的試管中，加入10%的甘油。相等體積的上浮物用SDS(12%)分離，如前所述的用蛋白凝膠斑點(diǎn)分析。煙草(NicotianatabacU原生質(zhì)體總蛋白使用歐冠USB蛋白萃取緩沖液萃取(20mMTris-HCl，pH7.5，8M尿素，4.5%SDS以及1M6-巰基乙醇)，用SDS分離，蛋白凝膠斑點(diǎn)分析。制備葉綠體各組份，收集3.5X10源生質(zhì)體用于轉(zhuǎn)化各組合。原生質(zhì)體在原生質(zhì)體溶解緩沖液中冰處理30分鐘(50mMHEPES,pH