乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座

——試驗設(shè)計乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第1頁綱領(lǐng)一、研究背景；二、研究內(nèi)容；三、試驗材料及方法；四、試驗數(shù)據(jù)分析；四、后續(xù)工作展望。乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第2頁一、研究背景

乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及其抑制劑

乙酰膽堿酯酶在人體中主要存在于神經(jīng)肌肉組織突觸后膜上,已知其主要功效是催化乙酰膽堿分解,在膽堿能神經(jīng)纖維信號傳導(dǎo)中飾演主要角色。

乙酰膽堿酯酶催化乙酰膽堿分解，直接造成神經(jīng)信號傳遞失敗,引發(fā)老年癡呆癥。AChE抑制劑AChE抑制劑可競爭性或非競爭性抑制乙酰膽堿酯酶活性，使得乙酰膽堿正常釋放，神經(jīng)沖動正常進行，可起到治療老年癡呆癥作用。

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第3頁二、研究內(nèi)容

1.試驗?zāi)Ｐ停毫虼阴Ｄ憠A(ATch)在乙酰膽堿酯酶(AChE)作用下分解,生成硫代膽堿,硫代膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)快速作用,生成在412nm處有光吸收黃色物質(zhì),在酶催化反應(yīng)穩(wěn)態(tài)階段其OD值即可代表起始反應(yīng)速率。

2.AChE抑制劑對AChEIC50值測定(IC50:即抑制率為50%時抑制劑濃度).3.樣品中AChE抑制劑對AChE抑制類型研究。乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第4頁三、試驗材料及方法

試驗主要儀器、試劑

1.儀器：分光光度計2.主要試劑：乙酰膽堿酯酶(AChE);50mmol/L、pH8.0PBS;15mmol/L二硫二硝基苯甲酸(DTNB)溶液(用50mmol/L,pH8.0PBS配制),15mmol/L硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine,ATch,用50mmol/L,pH8.0PBS配制),4%十二烷基硫酸鈉(SDS)等。

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第5頁三、試驗材料及方法

試驗方法樣品提純及處理試驗選擇適當(dāng)?shù)牡孜餄舛攘虼阴Ｄ憠A標(biāo)準曲線的繪制。AChE抑制劑對AChEIC50值的測定抑制劑對α-葡萄糖苷酶抑制類型的確定乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第6頁三、試驗材料及方法

1.樣品提純及處理。

提取樣品后，烘干后，用PBS緩沖液定容到終濃度10mg/L。2.經(jīng)過試驗選擇適當(dāng)?shù)孜餄舛确秶?/p>

反應(yīng)體系中酶量為120μL15mM/3mL。經(jīng)過一系列底物濃度，確定最適濃度范圍。乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第7頁三、試驗材料及方法

3.硫代乙酰膽堿標(biāo)準曲線繪制。

分別吸收20，40，60，80，100，120μL15mM硫代乙酰膽堿標(biāo)準液，加入等量顯色劑二硫二硝基苯甲酸（DTNB)，以PBS緩沖液定量至3mL測定412nm處吸光值。橫軸為5mL測試液中硫代乙酰膽堿微摩爾數(shù)，縱軸為吸光值，繪制標(biāo)準曲線。

（用于后面濃度定量。）

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第8頁三、試驗材料及方法

4.AChE抑制劑對AChEIC50值測定

2.65mLPBS(pH8.0),50μL乙酰膽堿酯酶(0.85U/mL),100μL15mMDTNB和樣品溶液100μL加入試管，37℃預(yù)熱2min，然后加入100μL15mM硫代乙酰膽堿（起始濃度是0.5mM），在37℃保溫20min后馬上加入1mL0.4％SDS終止反應(yīng)，將所得溶液馬上在412nm下測量吸光值并依據(jù)下式計算抑制率：抑制率(％)=[A對照-(A樣品-A樣品空白)]/A對照×100。按照公式計算抑制率，以橫坐標(biāo)為酶促反應(yīng)體系中抑制劑濃度，縱坐標(biāo)為抑制率，繪制曲線，計算其抑制率為50%時抑制劑濃度，即為IC50。

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第9頁三、試驗材料及方法

5.抑制劑對乙酰膽堿酯酶抑制類型確實定（1）抑制作用是否可逆在酶促反應(yīng)體系中加入不一樣濃度酶液，加入一定量抑制劑，以酶濃度為橫坐標(biāo)，以初速度為縱坐標(biāo)，繪制曲線。依據(jù)曲線形態(tài)判斷抑制作用是否可逆。（2）抑制動力學(xué)常數(shù)測定及類型判定以不一樣濃度硫代乙酰膽堿為底物，加入一定量抑制劑或不加抑制劑，測定反應(yīng)速度。采取Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法和Dixon作圖法，確定抑制動力學(xué)常數(shù)并判斷抑制類型。

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第10頁四、試驗數(shù)據(jù)分析

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第11頁

可逆抑制，判斷其抑制類型。競爭性抑制?or非競爭性抑制?or反競爭性抑制?

四、試驗數(shù)據(jù)分析米氏方程乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第12頁判斷可逆不可逆四、試驗數(shù)據(jù)分析乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第13頁

四、試驗數(shù)據(jù)分析乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第14頁

四、試驗數(shù)據(jù)分析乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第15頁

四、試驗數(shù)據(jù)分析乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第16頁二、研究內(nèi)容

乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第17頁

Dixon作圖法求Ki

只要以[I]為橫坐標(biāo)，以1/v為縱坐標(biāo)，采取1個以上[S]，給出不一樣[S]時直線，由這些直線交點即可求得Ki.四、試驗數(shù)據(jù)分析乙酰膽堿酯酶抑制劑活性研究專家講座第18頁五、后續(xù)工作展望阿爾茨海默病(Alzheimerpsdisease,AD)又稱早老性癡呆(preseniledementia),是發(fā)生于老年和老年前期以進行性癡呆為特征大腦退形性病變。老年人中AD發(fā)病率較高。伴隨我國人民生活水平不停提升和健康衛(wèi)生事業(yè)不停發(fā)展,不少城市人口老齡化現(xiàn)象日益嚴重,如北京、上海等地,60歲以上人群中就約有5%AD患者。AD臨床表現(xiàn)為進行性認知功效減退,并伴隨行為障礙及情緒異常等,直至生活不能自理。其發(fā)病率和死亡率較高,故AD日益成為當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)面臨最為嚴峻問題之一。

AD病人膽堿能系統(tǒng)受到損害造成突觸部位乙酰膽堿含量降低,從而使病人學(xué)習(xí)和記憶能力喪失。所以針對提升AD病人腦中乙酰膽堿含量,促進膽堿能神經(jīng)功效藥品不停出現(xiàn),尤其是乙酰膽堿酯