細(xì)胞工程專題知識(shí)講座

1.細(xì)胞工程(cellengineering)基本原理細(xì)胞是組成生物體基本單元。細(xì)胞本身、細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物含有十分主要用途，如醫(yī)藥產(chǎn)品，診療試劑，生物催化劑及各種精細(xì)化學(xué)品等。

細(xì)胞工程：就是經(jīng)過大規(guī)模細(xì)胞或組織培養(yǎng)，取得所需要產(chǎn)品技術(shù)。{細(xì)胞—細(xì)胞工程操作對(duì)象。

細(xì)胞工程（據(jù)研究對(duì)象）植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程{細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第1頁1.1細(xì)胞工程基本原理

細(xì)胞全能性是指已經(jīng)分化細(xì)胞在適當(dāng)條件下含有潛在發(fā)育成完整植株或個(gè)體能力。全能性這個(gè)概念在20世紀(jì)70年代，已經(jīng)在植物細(xì)胞上完全得到證實(shí)和發(fā)展。對(duì)微生物而言，一個(gè)微生物細(xì)胞就是一個(gè)生命，在適當(dāng)條件下，能夠形成一個(gè)單菌落，而且含有自我復(fù)制、新陳代謝等生命基本特征。細(xì)胞全能性是細(xì)胞工程學(xué)科領(lǐng)域理論關(guān)鍵。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第2頁干細(xì)胞研究結(jié)果（干細(xì)胞發(fā)覺）否定了動(dòng)物細(xì)胞不含有全能性傳統(tǒng)觀念。同食品工業(yè)親密相關(guān)是離體細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。細(xì)胞全能性概念在20世紀(jì)80年代之后又深入發(fā)展，細(xì)胞不但含有發(fā)育成完整植株和個(gè)體潛能，而且含有在細(xì)胞水平上表示出有用次生代謝物等多方面能力。

細(xì)胞含有全能性是因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都有一套完整基因組。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第3頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第4頁百合愈傷組織分化細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第5頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第6頁1.2細(xì)胞工程基本操作細(xì)胞工程基本操作有：無菌操作技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)。①無菌操作技術(shù)細(xì)胞工程全部試驗(yàn)都要求在無菌條件下進(jìn)行。試驗(yàn)操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行。

超凈工作臺(tái)是最基本試驗(yàn)設(shè)備，一切操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。

其次，對(duì)生物材料、試驗(yàn)所用一切器械、器皿、藥品等都應(yīng)進(jìn)行滅菌或除菌。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第7頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第8頁②細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下保留和生長(zhǎng)。

最終，將生物材料接種于培養(yǎng)基中后，放入適當(dāng)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)：首先，要取材和除菌；

其次，依據(jù)各類細(xì)胞特點(diǎn)，配制對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第9頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第10頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第11頁③細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合：兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，造成細(xì)胞合并，染色體等遺傳物質(zhì)重組過程。

細(xì)胞融合是細(xì)胞工程主要技術(shù)，主要過程包含：a：原生質(zhì)體制備；b：誘導(dǎo)細(xì)胞融合；c：篩選雜合細(xì)胞等過程。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第12頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第13頁2.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)包含微生物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和植物細(xì)胞培養(yǎng)。

經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)能夠得到大量細(xì)胞或其代謝物，如單細(xì)胞蛋白（SCP）、抗生素、氨基酸、酶制劑、疫苗等，含有廣泛用途。2.1微生物細(xì)胞培養(yǎng)2.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)｛培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基種類培養(yǎng)方法自學(xué)細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第14頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第15頁2.3植物細(xì)胞培養(yǎng)2.3.1植物細(xì)胞培養(yǎng)基組成及種類植物細(xì)胞培養(yǎng)｛（廣義）：在無菌條件下，將離體單個(gè)游離細(xì)胞在人工控制環(huán)境中培養(yǎng)，以取得再生完整植株或生產(chǎn)含有經(jīng)濟(jì)價(jià)值其它生物產(chǎn)品一個(gè)技術(shù)。（食品工業(yè)意義）：主要指細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，即游離植物細(xì)胞或一些小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中增殖并分離提取細(xì)胞產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第16頁培養(yǎng)基組成：①無機(jī)鹽無機(jī)鹽主要有K+、NH4+、Ca2+、Mg2+、P、S等，微量元素包含B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co和Fe等。②碳源普通以蔗糖或葡萄糖糖為碳源，果糖和麥芽糖利用效果差一些。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖含量，可增加培養(yǎng)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物量。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第17頁③有機(jī)氮源通常采取有機(jī)氮源有蛋白質(zhì)水解物，谷氨酰胺或氨基酸混合物。有機(jī)氮源對(duì)細(xì)胞早期培養(yǎng)早期生長(zhǎng)階段有利。④植物生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)激素｛生長(zhǎng)素：有吲哚乙酸（IAA)、萘乙酸（NAA）等，含有誘導(dǎo)細(xì)胞分裂作用，使用濃度普通為0.1～5mg/L。分裂素：有激動(dòng)素（N-6-呋喃甲基腺嘌呤）、6-芐基腺嘌呤、玉米素等，分裂素對(duì)芽誘導(dǎo)有主要作用，使用濃度普通為0.01～1mg/L。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第18頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第19頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第20頁⑤維生素植物細(xì)胞培養(yǎng)需要加入硫胺素，假如加入煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素等效果更加好。⑥復(fù)合物質(zhì)復(fù)合物質(zhì)通常作為細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)整劑，有酵母抽提液、麥芽抽提液、水果汁等。培養(yǎng)基種類（用途）｛固體培養(yǎng)基：主要用于誘發(fā)外植體形成愈傷組織及愈傷組織繼代培養(yǎng)等。液體培養(yǎng)基：主要用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第21頁2.3.2植物細(xì)胞培養(yǎng)方法植物細(xì)胞培養(yǎng)方法各種多樣，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)中應(yīng)用最多一個(gè)培養(yǎng)方法。

下面重點(diǎn)講述植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。①懸浮細(xì)胞培養(yǎng)概念

指將組織培養(yǎng)物分離成單細(xì)胞，懸浮在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)方法。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第22頁②植物細(xì)胞培養(yǎng)基本操作過程

整體植株→植物組織或器官→外植體→在固體培養(yǎng)基上誘發(fā)愈傷組織→愈傷組織繼代培養(yǎng)→懸浮培養(yǎng)

a：植物組織培養(yǎng)指在無菌條件下，將離體植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟果實(shí)、種子等）、組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（如成熟胚胎和未成熟胚胎）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配置培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽或長(zhǎng)成新完整植株一個(gè)技術(shù)。植物細(xì)胞培養(yǎng)是組織培養(yǎng)技術(shù)之一。③幾個(gè)主要概念細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第23頁b:外植體指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)離體材料，能夠是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。c:愈傷組織指外植體組織增生細(xì)胞產(chǎn)生一團(tuán)不定型疏松排列薄壁細(xì)胞。

d:繼代培養(yǎng)指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，營(yíng)養(yǎng)枯竭，水分散失，并已積累了一些代謝產(chǎn)物，此時(shí)需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。胡蘿卜愈傷組織細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第24頁當(dāng)歸愈傷組織及組織分化細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第25頁香茶菜愈傷組織及分化苗細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第26頁④植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)要求b:懸浮培養(yǎng)條件通常采取水平振蕩，振幅2～4cm為宜；溫度24～30℃為宜；在培養(yǎng)過程中需連續(xù)不停供氧，使氧溶解量維持在一定水平；大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)pH為5～7；細(xì)胞起始密度普通為0.5～2.5×105個(gè)/ml。a:選擇適當(dāng)培養(yǎng)材料普通選取疏松易碎愈傷組織進(jìn)行起始懸浮培養(yǎng)。另一個(gè)材料是取自植物莖部組織或幼胚，將其組織破碎后利用破碎組織進(jìn)行液體懸浮振蕩培養(yǎng)。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第27頁c:剪切力對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響植物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。剪切力對(duì)植物細(xì)胞影響主要表現(xiàn)在兩方面：一、主動(dòng)影響。二、負(fù)面影響。d:預(yù)防細(xì)胞凝聚成塊植物細(xì)胞極少以單一細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，含有聚集在一起特征，輕易積聚成細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第28頁e:保持細(xì)胞培養(yǎng)無菌植物細(xì)胞培養(yǎng)基成份復(fù)雜而且豐富，適合微生物生物生長(zhǎng)，極易造成污染。植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)。⑤懸浮培養(yǎng)方法主要包含分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)等。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第29頁a:分批培養(yǎng)法

指在新鮮培養(yǎng)基中加入少許細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中既不從培養(yǎng)系統(tǒng)中放出培養(yǎng)液，也不從外界向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)加培養(yǎng)基一個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞方法。

分批培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便，廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)室和生產(chǎn)中。特征：培養(yǎng)基基質(zhì)濃度是隨培養(yǎng)時(shí)間增加而下降，細(xì)胞濃度和產(chǎn)物隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加。細(xì)胞經(jīng)歷誘導(dǎo)期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定時(shí)和衰亡期。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第30頁b:半連續(xù)培養(yǎng)法

指在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換培養(yǎng)方法。

特征：可不停補(bǔ)充培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成份，降低接種次數(shù)，使培養(yǎng)細(xì)胞所處環(huán)境與分批培養(yǎng)一樣隨時(shí)間而改變。

工業(yè)生產(chǎn)中為簡(jiǎn)化操作過程，確保細(xì)胞增殖量，常采取半連續(xù)培養(yǎng)法。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第31頁c:連續(xù)培養(yǎng)法

指在培養(yǎng)過程中，不停抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不停得到養(yǎng)分補(bǔ)充和保持其恒定體積培養(yǎng)方法。特征：一、因?yàn)椴煌＜尤胄迈r培養(yǎng)基，確保了養(yǎng)分充分供給，不會(huì)出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)物發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良現(xiàn)象；二、連續(xù)培養(yǎng)可在培養(yǎng)期間，使細(xì)胞長(zhǎng)久保持在對(duì)數(shù)期，細(xì)胞增殖速率快；三、連續(xù)培養(yǎng)適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第32頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第33頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第34頁2.3.3植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器20世紀(jì)70年代，開始研究植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，主要借助微生物培養(yǎng)時(shí)廣泛應(yīng)用攪拌式生物反應(yīng)器。

植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器必須最大程度發(fā)揮植物細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物潛力。

隨即，剪切力較小鼓泡柱反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器得到人們青睞。

植物細(xì)胞培養(yǎng)中也出現(xiàn)了微生物發(fā)酵中不常見轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器和膜生物反應(yīng)器等。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第35頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第36頁以上幾個(gè)用于植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器及其應(yīng)用以下：

反應(yīng)器類型

植物細(xì)胞體系攪拌式反應(yīng)器長(zhǎng)春花、胡蘿卜、毛地黃、煙草等鼓泡柱反應(yīng)器大豆、煙草等氣生式反應(yīng)器長(zhǎng)春花、雷公藤等膜生物反應(yīng)器煙草、長(zhǎng)春花、人參細(xì)胞等轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器紫草等細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第37頁

當(dāng)前，鼓泡床反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器最慣用于植物細(xì)胞培養(yǎng)。

鼓泡床反應(yīng)器：是微生物好氧發(fā)酵采取最簡(jiǎn)單反應(yīng)器之一。優(yōu)點(diǎn)：密封性好，剪切力小，易放大。缺點(diǎn)：反應(yīng)器內(nèi)部液體流型不穩(wěn)定。

氣升式反應(yīng)器：空氣在導(dǎo)流管中與培養(yǎng)基混合，既為植物細(xì)胞生長(zhǎng)提供了必需氧氣和良好混合，流體剪切力又比較適合植物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝，而且沒有機(jī)械傳動(dòng)。在植物細(xì)胞培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第38頁膜生物反應(yīng)器細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第39頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第40頁氣升式反應(yīng)器細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第41頁細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第42頁鼓泡反應(yīng)器細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第43頁5L光照植物細(xì)胞培養(yǎng)罐40噸

植物細(xì)胞培養(yǎng)罐（紫杉醇細(xì)胞）細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第44頁3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指離散動(dòng)物細(xì)胞在體外人工無菌條件下生長(zhǎng)增殖，在整個(gè)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。培養(yǎng)細(xì)胞類型：懸浮型和貼附型慣用培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基如血清。合成培養(yǎng)基如eagle基本培養(yǎng)基、DMEM等。需加一定百分比天然成份，最普通是加入血清。無血清培養(yǎng)基。

細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第45頁原代培養(yǎng)—培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞大都取自動(dòng)物胚胎或出生很快幼齡動(dòng)物器官或組織，將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后配制成一定濃度細(xì)胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個(gè)過程稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)—細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)。伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞越來越多，需要定時(shí)地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第46頁培養(yǎng)方法：懸浮培養(yǎng)、帖壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)、大規(guī)模培養(yǎng)法。

大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是在帖壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)基礎(chǔ)上，融合了固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、生物反應(yīng)罐技術(shù)等發(fā)展起來。空心纖維法微載體法微囊法細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第47頁動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成含有一定彈性和韌性組織和器官。用胰蛋白酶分散細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜pH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶（7.2-8.4）活性較高。胰蛋白酶細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第48頁當(dāng)繼續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，少部分細(xì)胞會(huì)克服細(xì)胞壽命極限，取得不死性，這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了突變，正在朝著同等于癌細(xì)胞方向發(fā)展。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第49頁

左圖顯示了創(chuàng)面愈合過程中一個(gè)十分有趣現(xiàn)象。當(dāng)周圍上皮向創(chuàng)面中央爬行時(shí),一旦上皮細(xì)胞相互接觸,就停頓分化和增殖。該現(xiàn)象就叫“接觸抑制”。所以,創(chuàng)面上不會(huì)出現(xiàn)多出皮贅。這是一個(gè)十分巧妙和“神秘”調(diào)控現(xiàn)象。細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第50頁細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)過程中，伴隨細(xì)胞分裂，數(shù)量不停增加，最終形成一個(gè)單層，此時(shí)細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)停頓，數(shù)量不再增加。細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第51頁CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱萬級(jí)潔凈細(xì)胞培養(yǎng)室細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第52頁4.細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合：又稱細(xì)胞雜交，是指將不一樣起源原生質(zhì)體（除去細(xì)胞壁細(xì)胞）相融合，并使之分化、再生、形成新物種或新品種技術(shù)?；蚝?jiǎn)單定義為將兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞融合在一個(gè)細(xì)胞過程。

細(xì)胞融合技術(shù)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來一項(xiàng)細(xì)胞工程技術(shù)。細(xì)胞融合這種生物現(xiàn)象最初是在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)覺。現(xiàn)已證實(shí)其能夠在種間、屬間、科間甚至動(dòng)物與植物間發(fā)生，其范圍包含動(dòng)物、植物和微生物。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第53頁

細(xì)胞融合技術(shù)不但在基礎(chǔ)研究（如核質(zhì)相互關(guān)系、基因作用和定位等）方面有主要作用，而且在動(dòng)植物改良、微生物育種、疾病診治等方面都有良好發(fā)展前景，已經(jīng)成為細(xì)胞工程中關(guān)鍵技術(shù)。3.1細(xì)胞融合方法及其作用機(jī)理3.1.1生物學(xué)法主要采取病毒促進(jìn)細(xì)胞融合。許多病毒，如仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、一些致癌病毒均能誘導(dǎo)細(xì)胞融合，其中仙臺(tái)病毒（HVJ)是最早應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞融合融合劑。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第54頁采取滅活病毒促進(jìn)細(xì)胞融合細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第55頁

仙臺(tái)病毒，也稱日本血凝病毒，屬粘液病毒副流感類群，多型顆粒狀，RNA病毒，易在小鼠中蔓延。其毒力低，對(duì)人危害小，而且易被紫外線等滅活，是生物學(xué)方法中最慣用細(xì)胞融合劑。

病毒能夠用作融合劑機(jī)理：

許多病毒都含有凝集細(xì)胞并使凝集細(xì)胞發(fā)生融合能力。許多病毒（如仙臺(tái)病毒）還含有促進(jìn)凝集細(xì)胞發(fā)生融合能力（因?yàn)楦鞣N能被其作用細(xì)胞均含有對(duì)應(yīng)受體位點(diǎn)原因）。

現(xiàn)已知道病毒促進(jìn)融合有效部位在細(xì)胞膜上。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第56頁4.1.2化學(xué)融合劑法

化學(xué)融合劑主要包含：PEG、二甲亞砜、甘油醋酸酯等，在Ca2+存在下皆可促進(jìn)細(xì)胞融合。其中，PEG應(yīng)用更為廣泛。PEG，聚乙二醇，是一個(gè)多聚化合物，表面活性劑，其活性穩(wěn)定，使用方便。同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞融合能力較強(qiáng)。

PEG與水分子以氫鍵結(jié)合，使自由水消失，造成高度脫水原生質(zhì)體凝集融合，融合時(shí)必須有Ca2+參加。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第57頁4.1.3電處理融正當(dāng)

電融正當(dāng)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)細(xì)胞融合技術(shù)。當(dāng)細(xì)胞處于電場(chǎng)中，細(xì)胞壁兩面產(chǎn)生電勢(shì)，其數(shù)值與外加電場(chǎng)強(qiáng)度以及細(xì)胞半徑成正比。因?yàn)榧?xì)胞膜兩面相對(duì)電荷正負(fù)相吸，使細(xì)胞膜變薄，伴隨外加電場(chǎng)強(qiáng)度升高，膜電場(chǎng)增強(qiáng)，當(dāng)膜電勢(shì)增強(qiáng)到臨界電勢(shì)時(shí)，細(xì)胞膜處于臨界膜厚度，造成發(fā)生局部不穩(wěn)定和降解，從而形成微孔，進(jìn)而質(zhì)膜開始連接，直到閉合，完成融合。

優(yōu)點(diǎn)：如融合率高；重復(fù)性強(qiáng)；對(duì)原生質(zhì)體傷害??；可在顯微鏡下觀察或錄像融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后洗滌過程；誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)等。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第58頁4.2細(xì)胞融合技術(shù)以微生物細(xì)胞為例，講述細(xì)胞融合方法和過程。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第59頁4.2.1微生物原生質(zhì)體制備要制備微生物原生質(zhì)體，必須有效除去細(xì)胞壁。

細(xì)菌：

細(xì)胞壁主要成份是肽聚糖。普通G+菌易被溶菌酶消化除壁；

Gˉ細(xì)胞壁成份及結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，必須采取溶菌酶和EDTA一起處理。普通溶菌酶用量為100～1000U/ml。

各類微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成不一樣，需采取不一樣方法脫壁。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第60頁

放線菌：

是一類形態(tài)及分化特征較獨(dú)特微生物，分類上屬于G+，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于其它G+（肽聚糖為主），普通放線菌慣用溶菌酶處理。

真菌：

細(xì)胞壁成份主要是纖維素，幾丁質(zhì)和葡聚糖等。

酵母菌慣用蝸牛酶和酵母裂解酶；

青霉、曲霉多用纖維素酶和糖苷酶等處理（青霉用α-1，3糖苷酶，曲霉用β-1，3糖苷酶和β-1，4糖苷酶）。有絲狀真菌還需添加蝸牛酶、殼聚糖酶等配合使用。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第61頁原生質(zhì)體細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第62頁

原生質(zhì)體制備之前，微生物細(xì)胞需經(jīng)過種子培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期為宜。普通而言，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久菌體輕易被對(duì)應(yīng)酶酶解脫壁，原生質(zhì)體生成率最高。其它時(shí)期原生質(zhì)體生成量會(huì)有比較大不一樣，尤其是穩(wěn)定時(shí)，其得率會(huì)急劇下降。

原生質(zhì)體形成以后，就必須使其處于一個(gè)適當(dāng)滲透壓環(huán)境中，這么才能免于破裂。注意：細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第63頁

原生質(zhì)體對(duì)滲透壓敏感，所以，在瓊脂平板上涂布培養(yǎng)后其會(huì)在低滲條件下破裂失活，不能形成菌落，菌落越少，說明原生質(zhì)體化效果越好。原生質(zhì)體形成率=原生質(zhì)體數(shù)/未經(jīng)酶處理總菌數(shù)3.2.2微生物原生質(zhì)體融合

融合：就是把兩個(gè)或多個(gè)親本原生質(zhì)體混合起來，使其形成融合子過程。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第64頁

最慣用融合方法是PEG融合和電融合。

以PEG為例說明融合過程：①作好兩種原生質(zhì)體識(shí)別標(biāo)識(shí)，如色素、缺點(diǎn)型、抗性標(biāo)識(shí)等。②原生質(zhì)體密度為105個(gè)/ml左右，兩種原生質(zhì)體按照1∶1等量混合，離心去除上清液，沉渣置于高滲穩(wěn)定液中，加40%PEG，用滴管輕輕吹打，使細(xì)胞分散均勻。③適當(dāng)溫度水浴保溫一定時(shí)間，稀釋。④取少許最終稀釋液涂布到高滲再生平板上，培養(yǎng)。⑤檢驗(yàn)細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第65頁4.2.3微生物原生質(zhì)體再生

原生質(zhì)體再生：使原生質(zhì)體重新生長(zhǎng)出細(xì)胞壁，回復(fù)到完整細(xì)胞形態(tài)過程。

原生質(zhì)體再生是使用原生質(zhì)體融合進(jìn)行育種一個(gè)必要步驟，假如原生質(zhì)體化后不能再生，不能生成完整細(xì)胞，則就失去了意義。

原生質(zhì)體再生條件較為嚴(yán)格，而且不一樣微生物又有所不一樣。共同點(diǎn)—需要高滲環(huán)境。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第66頁

原生質(zhì)體能再生細(xì)胞壁，回復(fù)到細(xì)胞形態(tài)總只是其中一部分。為了得到較高再生率：

a:在試驗(yàn)過程中，操作條件溫和，防止因?yàn)闄C(jī)械力量引發(fā)原生質(zhì)體破碎；

b:再生用平板培養(yǎng)基在涂布前，應(yīng)先除去培養(yǎng)基表面多出冷凝水；

c:原生質(zhì)體再生活性和制備中一些條件親密相關(guān)，如菌齡、酶用量、酶作用時(shí)間等；

d:原生質(zhì)體再生培養(yǎng)階段外加一些物質(zhì)能夠提升原生質(zhì)體再生率，普通是加入細(xì)胞壁合成引物。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第67頁4.2.4微生物融合子篩選

融合子：原生質(zhì)體融合后，來自兩親本遺傳物質(zhì)經(jīng)過交換并發(fā)生重組而形成子代細(xì)胞。

篩選方法直接法：微生物原生質(zhì)體融合中較慣用。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)型親本，可從高滲再生基本培養(yǎng)基（不補(bǔ)充兩個(gè)親本必須營(yíng)養(yǎng)物）上直接篩選；對(duì)于抗藥性作為選擇標(biāo)識(shí)融合，可從含藥品平板上分離判定。間接法：把融合液涂布在高滲再生完全培養(yǎng)基上，使親本細(xì)胞和融合子都再生成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出融合子。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第68頁

融合后取得僅僅是融合子，還需要對(duì)它們進(jìn)行生理生化測(cè)定及生產(chǎn)性能測(cè)定，以確定是否符合育種要求。3.3微生物原生質(zhì)體融合優(yōu)點(diǎn)①有較高誘變率去除了細(xì)胞壁障礙，誘變效率比較高，尤其是對(duì)一些原來對(duì)誘變劑作用不敏感微生物。②重組子類型多原生質(zhì)體融合后，兩個(gè)親株整套基因相互接觸，能夠有充分機(jī)會(huì)發(fā)生屢次交換，產(chǎn)生各種各樣基因組合而得到各種類型重組子，而且參加融合親株數(shù)不限于兩個(gè)，能夠是三個(gè)、四個(gè)等。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第69頁③有較高融合率借助各種方法，能夠得到較高融合率。④能夠與各種育種方法結(jié)合使用⑤與較高篩選率能夠用溫度、藥品和紫外線照射等處理鈍化親株一方或雙方，然后再使之融合，這么能夠在篩選中除去某一親株一方不良性狀，提升篩選效率。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第70頁5.固定化細(xì)胞技術(shù)5.1細(xì)胞固定化定義和意義

細(xì)胞固定化：是指將游離細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行無菌培養(yǎng)一門技術(shù)。

固定化技術(shù)最早在酶工程中得到應(yīng)用。酶含有催化反應(yīng)專一性強(qiáng)、催化效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。但實(shí)際生產(chǎn)中，因?yàn)槠鋬r(jià)格昂貴，傳統(tǒng)分批式操作使得有活性酶回收比較困難，而且在有些有機(jī)溶劑及高溫條件下使用時(shí)，酶極易失活，酶固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第71頁

細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)新型細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，尤其適合于細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物。與懸浮游離細(xì)胞相比較，植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)含有以下優(yōu)點(diǎn)：①固定化細(xì)胞生長(zhǎng)速度較游離細(xì)胞遲緩，有利于次生代謝產(chǎn)物積累。②易于控制環(huán)境，收獲次生代謝產(chǎn)物。③細(xì)胞經(jīng)包埋后使其所受剪切力損傷減小。④易取得高密度細(xì)胞群體。⑤有利于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第72頁5.2完整細(xì)胞固定化方法

主要有：吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)法。

經(jīng)慣用到固定劑主要是一些多糖和多聚化合物等，如海藻酸鈉、卡拉膠、瓊脂、瓊脂糖、角叉藻聚糖、明膠、聚丙烯酰胺等。

下面重點(diǎn)以海藻酸鈉作為固定劑介紹細(xì)胞固定化方法。

海藻酸鹽與Ca2+交聯(lián)是完整細(xì)胞包埋技術(shù)中一個(gè)慣用方法。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第73頁

海藻酸鹽是一個(gè)由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸組成多糖，在Ca2+等多價(jià)陽離子存在下，糖中羧基和陽離子之間形成離子鍵，從而形成膠體顆粒。假如采取磷酸、檸檬酸、EDTA等離子復(fù)合劑處理，又能使膠體顆粒溶解釋放出細(xì)胞。

小規(guī)模固定化能夠用無菌塑料注射器進(jìn)行。詳細(xì)步驟以下：配制一定濃度海藻酸鈉溶液，高溫高壓滅菌將離心搜集生物細(xì)胞懸浮液與海藻酸鈉溶液混合將混合液倒入塑料注射器中，然后慢慢滴入到含有CaCl2培養(yǎng)基中，不停攪拌，形成球形顆粒過濾搜集顆粒用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基清洗轉(zhuǎn)入裝有培養(yǎng)基搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第74頁

大規(guī)模固定化步驟基本與上述相同，不一樣是采取專門固定化裝置進(jìn)行固定化。示意圖如圖：

工作原理：經(jīng)過鼓入無菌空氣將海藻酸鈉溶液和細(xì)胞懸液噴入含有Ca2+培養(yǎng)基中。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第75頁6.細(xì)胞工程在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用6.1植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用植物細(xì)胞工業(yè)規(guī)?；囵B(yǎng)首先是細(xì)胞生物量增加。如人參細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模已達(dá)2m3，我國(guó)也到達(dá)日產(chǎn)10kg濕細(xì)胞產(chǎn)量。搜集濕細(xì)胞，凍干，得到活性人參細(xì)胞粉，既是保健食品原料，亦可作為藥材。其中除含人參皂甙外，尚含有酶類及其它活性成份，其保健作用優(yōu)于天然人參。①西洋參細(xì)胞培養(yǎng)工藝舉例：西洋參屬五加科，人參屬植物，為名貴中藥材之一，其所含主要有效成份為皂甙，當(dāng)前尚不能人工合成。細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第76頁工藝流程懸浮培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)發(fā)酵液過濾細(xì)胞干燥西洋參細(xì)胞干粉成品過濾細(xì)胞干燥過濾細(xì)胞干燥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)發(fā)酵液西洋參細(xì)胞干粉成品細(xì)胞干燥無菌根誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織懸浮培養(yǎng)發(fā)酵液懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)西洋參細(xì)胞干粉成品干燥發(fā)酵液懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)西洋參根乙醇消毒過濾細(xì)胞西洋參細(xì)胞干粉成品干燥發(fā)酵液懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物大量培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞工程專題知識(shí)講座第77頁②利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料

利用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能生產(chǎn)各種香料物質(zhì)。

比如，在洋蔥細(xì)胞培養(yǎng)中，從蒜堿酶抑制劑羥基胺中提取出了香料物質(zhì)前體—烷基半胱氨酸磺胺化合物。在玫