宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用專(zhuān)家講座

宏基因組技術(shù)在微生物中應(yīng)用蔣超4031031182宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第1頁(yè)1.宏基因組概述2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)3.環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)主要瓶頸宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第2頁(yè)1.宏基因組概述

1.1.微生物資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用新路徑據(jù)預(yù)計(jì)每克土壤樣品中可含有高達(dá)4,000種不一樣微生物，1g土壤就包含6.1×107個(gè)基因。傳統(tǒng)路徑—培養(yǎng)路徑開(kāi)發(fā)環(huán)境微生物基因資源較為傳統(tǒng)研究路徑是:分離微生物,取得純培養(yǎng),基因表示產(chǎn)物活性檢測(cè)、活性物質(zhì)分離純化直至開(kāi)發(fā)利用。這一路徑被證實(shí)是十分有效,也取得了很多有應(yīng)用價(jià)值活性物質(zhì)。不過(guò),環(huán)境中僅有0.1%~1%微生物能夠采取現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分離培養(yǎng),在今天采取傳統(tǒng)培養(yǎng)方法已極難發(fā)覺(jué)新活性物質(zhì),極大地限制了未培養(yǎng)微生物基因資源開(kāi)發(fā)利用。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第3頁(yè)新路徑—宏基因組路徑近年來(lái)發(fā)展起來(lái)宏基因組克隆技術(shù),直接提取環(huán)境樣品核酸進(jìn)行遺傳操作,避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)問(wèn)題,極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源利用空間。已在土壤生態(tài)環(huán)境、海洋生態(tài)環(huán)境和各種極端環(huán)境中開(kāi)展應(yīng)用。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第4頁(yè)宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第5頁(yè)1.2.宏基因組定義“1998年Handelsman等首次提出宏基因組概念。一個(gè)以環(huán)境樣品中微生物群體基因組為研究對(duì)象,以功效基因篩選和測(cè)序分析為研究伎倆,以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功效活性、相互協(xié)作關(guān)系、及與環(huán)境之間關(guān)系為研究目標(biāo)新微生物研究方法。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第6頁(yè)宏基因組文庫(kù)既包含了可培養(yǎng),又包含了未培養(yǎng)微生物遺傳信息,所以增加了取得新生物活性物質(zhì)機(jī)會(huì)。采取構(gòu)建宏基因組文庫(kù)策略篩選新基因資源及其表示活性產(chǎn)物普通流程能夠歸納為:樣品和基因(組)富集;提取特定環(huán)境中基因組DNA或mRNA;構(gòu)建宏基因組DNA或cDNA文庫(kù);篩選目標(biāo)基因;目標(biāo)基因活性產(chǎn)物表示。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第7頁(yè)

圖2宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第8頁(yè)宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第9頁(yè)2.環(huán)境宏基因組學(xué)基本技術(shù)環(huán)境宏基因組學(xué)研究基本思緒是直接提取環(huán)境中全部微生物基因組DNA,克隆到適當(dāng)載體,經(jīng)過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù),將環(huán)境中全部微生物核酸信息搜集在一起,利用序列篩選或功效篩選方式從文庫(kù)中取得有用酶、抗生素等生物活性物質(zhì)及相關(guān)基因。其前端關(guān)鍵性技術(shù)是環(huán)境DNA(environmentalDNA,eDNA)提取,eDNA提取方法準(zhǔn)確程度將直接決定文庫(kù)中微生物信息準(zhǔn)確度;下游關(guān)鍵性技術(shù)是文庫(kù)分析與篩選技術(shù)。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第10頁(yè)2.1環(huán)境樣品及目標(biāo)基因組富集在宏基因組文庫(kù)篩選過(guò)程中目標(biāo)基因僅占總DNA一小部分,對(duì)環(huán)境樣品預(yù)富集能夠大大提升目標(biāo)基因檢出幾率。當(dāng)前預(yù)富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平富集和基因組水平富集。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第11頁(yè)細(xì)胞水平富集主要是經(jīng)過(guò)利用選擇培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行富集培養(yǎng),最慣用方法是底物選擇,另外還包含營(yíng)養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標(biāo)選擇。不過(guò)因?yàn)楦患囵B(yǎng)選擇性地富集了含有快速生長(zhǎng)特征菌群,所以造成大部分物種多樣性信息丟失。當(dāng)前能夠經(jīng)過(guò)先在嚴(yán)格脅迫條件下短期處理,然后改為較溫和處理?xiàng)l件,能夠從一定程度上克服這種方法不足。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第12頁(yè)基因組水平富集慣用技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP),原理是采取穩(wěn)定同位素標(biāo)識(shí)底物,其中“重”原子摻入到含有代謝活性微生物核酸中,采取密度梯度離心方法將“重”DNA與“輕”組分分離,被標(biāo)識(shí)“重”核酸能夠作為PCR模板,用來(lái)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。另外,還有報(bào)道利用抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕捉技術(shù)及DNA微陣技術(shù)等技術(shù)來(lái)富集目標(biāo)基因。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第13頁(yè)2.2.環(huán)境宏基因組文庫(kù)篩選技術(shù)環(huán)境宏基因組文庫(kù)篩選策略主要分為序列篩選和功效篩選2種。序列篩選策略是先從文庫(kù)中取得目標(biāo)基因,繼而對(duì)之異源表示,得到含有生物活性產(chǎn)物;功效篩選策略則是先取得含有生物活性陽(yáng)性克隆子,再經(jīng)過(guò)插入片段測(cè)序,得到對(duì)應(yīng)基因結(jié)構(gòu)。2種分析策略對(duì)于充分利用宏基因文庫(kù)資源都是必要。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第14頁(yè)2.3宏基因組DNA提取取得高濃度、大片段、無(wú)偏好環(huán)境樣品總DNA是宏基因組文庫(kù)構(gòu)建難點(diǎn)之一。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第15頁(yè)近年已經(jīng)有各種宏基因組DNA提取純化方法陸續(xù)建立起來(lái),大致可分為兩類(lèi):一類(lèi)是直接提取法,又稱(chēng)原位提取法。這類(lèi)方法不經(jīng)過(guò)樣品中微生物培養(yǎng)和分離,經(jīng)過(guò)化學(xué)法、酶解法或物理法直接破碎環(huán)境中微生物細(xì)胞而使DNA得以釋放,并對(duì)DNA進(jìn)行純化。該法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成本低,所取得DNA含有很好完整性,并能夠代表某一生境微生物群落多樣性。但常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全或DNA與土壤雜質(zhì)成份產(chǎn)生共沉淀而無(wú)法有效地去除等問(wèn)題,所以普通需要深入DNA純化處理,同時(shí)所提取取得DNA片段較小(1kb~50kb),主要適合用于小片段文庫(kù)構(gòu)建。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第16頁(yè)另一類(lèi)是間接提取法,即異位提取法,是利用離心介質(zhì)或者梯度離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來(lái),再按處理純培養(yǎng)細(xì)胞方法裂解微生物細(xì)胞提取DNA。該法取得宏基因組DNA受到胞外雜質(zhì)污染干擾較少,純度較高、DNA完整性好(20kb~500kb),適合構(gòu)建大片段宏基因組文庫(kù)。但該法操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)、成本高、偏差大、DNA得率較低,其產(chǎn)率只是直接裂解法1%~10%,且取得DNA往往不能完全代表樣品所在生境生態(tài)學(xué)多樣性。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第17頁(yè)2.4宏基因組文庫(kù)構(gòu)建

載體選擇載體選擇在宏基因組技術(shù)中占有十分主要地位。載體系統(tǒng)選擇主要依賴(lài)于DNA提取質(zhì)量、插入片段、質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主菌及篩選方法。依據(jù)克隆載體不一樣宏基因組文庫(kù)可分為質(zhì)粒文庫(kù)、細(xì)菌/酵母人工染色體文庫(kù)、噬菌體類(lèi)載體文庫(kù)。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第18頁(yè)早期宏基因組文庫(kù)主要以質(zhì)粒載體和大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建而成小片段(<15kb)文庫(kù)。該文庫(kù)操作簡(jiǎn)便、拷貝數(shù)高、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高,適合純度低或剪切較嚴(yán)重DNA模版。但插入片段小,篩選量大,活性比率低,對(duì)大基因簇?zé)o能為力,主要適合用于分析新基因序列信息及篩選編碼代謝相關(guān)單一基因或小操縱子。然而,很多微生物活性物質(zhì)是其次生代謝產(chǎn)物,代謝路徑由多基因簇調(diào)控,所以盡可能插入大片段DNA以取得完整代謝路徑多基因簇是很有必要。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第19頁(yè)當(dāng)前多采取細(xì)菌人工染色體(BAC)和粘粒(Cosmid)載體,前者插入片段大(可達(dá)350kb),但克隆效率低,后者插入片段中等(20~40kb),克隆效率高。BAC和Cosmid載體在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性高,但拷貝數(shù)低,宏基因擴(kuò)增困難,表示量低。Fosmid載體插入片段與Cosmid相當(dāng),但Fosmid插入片段在E.coli中克隆效率和穩(wěn)定性更高。外源基因表示受宿主細(xì)胞遺傳類(lèi)型、細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞生理狀態(tài)及初級(jí)代謝產(chǎn)物等影響,利用穿梭載體擴(kuò)大宿主范圍有利于促使和提升外源基因表示。為提升和調(diào)控外源基因拷貝數(shù)與表示量,常需構(gòu)建不一樣類(lèi)型載體。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第20頁(yè)另外,λ-噬菌體和其它病毒也能夠作為構(gòu)建宏基因組克隆文庫(kù)載體。噬菌體展示庫(kù)是一個(gè)十分有效高通量篩選技術(shù),該技術(shù)經(jīng)過(guò)對(duì)表面展示表示產(chǎn)物親和選擇分離對(duì)應(yīng)DNA序列,能夠從宏基因組中富集稀有DNA序列,但其不足在于只能表示分子量小于50kD蛋白。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第21頁(yè)宿主細(xì)胞選擇宿主菌株選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性、宏基因表示、目標(biāo)性狀(如抗菌)缺點(diǎn)型等原因。研究經(jīng)驗(yàn)表明不一樣微生物種類(lèi)所產(chǎn)生活性物質(zhì)類(lèi)型有顯著差異,不一樣研究目標(biāo)應(yīng)選擇不一樣宿主菌株,如70%抗生素起源于放線菌,如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo),選擇鏈霉菌為宿主較理想,而篩選新酶則采取大腸桿菌為宜。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第22頁(yè)其中E.coli是最慣用宿主細(xì)胞,其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、繁殖快速、培養(yǎng)代謝易于控制。不過(guò)因?yàn)榄h(huán)境樣品總DNA有很大一部分為真核基因組DNA,其在細(xì)菌宿主中往往不能表示,大大限制了這部分基因篩選。最近生物信息學(xué)研究表明,對(duì)于一個(gè)插入子(<10kb)文庫(kù),為尋找一個(gè)目標(biāo)基因需要篩選105~106個(gè)克隆,這表明從復(fù)雜宏基因組中篩選目標(biāo)基因在技術(shù)上還存在著其特殊困難。所以,宿主系統(tǒng)深入探索是更有效開(kāi)發(fā)宏基因組資源關(guān)鍵技術(shù)之一。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第23頁(yè)2.5宏基因組文庫(kù)篩選因?yàn)楹昊蚪M文庫(kù)容量較大,目標(biāo)克隆子篩選一直是宏基因組學(xué)技術(shù)中瓶頸。近年來(lái),各種宏基因組文庫(kù)篩選方法相繼建立起來(lái),依據(jù)篩選原理大致分為兩大類(lèi):序列依賴(lài)性篩選法和非序列依賴(lài)性篩選法。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第24頁(yè)序列依賴(lài)性篩選法序列依賴(lài)性篩選法是依據(jù)文庫(kù)中已知序列或保守序列來(lái)設(shè)計(jì)雜交探針或PCR引物,從宏基因組文庫(kù)中篩選目標(biāo)序列。該法克服了功效篩選法中必須依賴(lài)表示后活性產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),效率較高。其中已知功效基因PCR擴(kuò)增技術(shù)是最為慣用序列依賴(lài)性篩選法。另外,DNA微陣技術(shù)和整合子系統(tǒng)技術(shù)也能夠作為序列依賴(lài)性篩選法。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第25頁(yè)不過(guò)已知功效基因PCR擴(kuò)增技術(shù)篩選法存在2個(gè)主要缺點(diǎn):(1)引物設(shè)計(jì)依賴(lài)于已經(jīng)有序列信息,共同進(jìn)化2個(gè)功效相同基因難于用“族特異性”引物區(qū)分開(kāi)來(lái),所以極難發(fā)覺(jué)新功效基因。(2)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增功效基因,普通只能取得結(jié)構(gòu)基因一個(gè)片段,而不能取得完整功效基因。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第26頁(yè)非序列依賴(lài)性篩選法非序列依賴(lài)性篩選法,其不依賴(lài)于任何已知序列信息,僅依據(jù)文庫(kù)克隆子產(chǎn)生活性物質(zhì)進(jìn)行篩選。其中以功效篩選法最為慣用,原理是直接對(duì)目標(biāo)克隆表示性狀在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。該法篩選能夠發(fā)覺(jué)全新活性物質(zhì)或全長(zhǎng)基因,但工作量大、效率低,生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物僅在少數(shù)情況下含有可見(jiàn)性狀,酶活性檢測(cè)受到研究方法限制。另外,因?yàn)槭艿矫富顧z測(cè)方法限制,大多數(shù)寶貴酶資源不能經(jīng)過(guò)上述基于活性方法發(fā)掘出來(lái)。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第27頁(yè)近期基因陷阱技術(shù)篩選法倍受研究學(xué)者們關(guān)注,(1)利用目標(biāo)基因缺失突變體宿主菌株,轉(zhuǎn)化后在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行功效互補(bǔ)生長(zhǎng)特征來(lái)篩選。(2)將宏基因組DNA隨機(jī)克隆到無(wú)開(kāi)啟子綠色熒光蛋白基因(GFP)前面,然后經(jīng)過(guò)熒光激活細(xì)胞分離(FACS)技術(shù),在添加特定底物條件下對(duì)表示庫(kù)進(jìn)行富集,就能夠選擇出對(duì)該底物含有代謝活性克隆。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第28頁(yè)該法優(yōu)點(diǎn)在于它為高通量篩選提供了保障,而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾,尤其適合于工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。但也存在一些問(wèn)題:(1)無(wú)法利用不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)底物;(2)熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)對(duì)進(jìn)樣設(shè)備要求也比較高;(3)建立高度耐受“超相容性”表示系統(tǒng),以表示任意起源編碼蛋白和酶含有一定難度。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第29頁(yè)3.環(huán)境宏基因組學(xué)技術(shù)主要瓶頸

3.1.環(huán)境宏基因組文庫(kù)前端技術(shù)主要瓶頸

eDNA提取技術(shù)尚存在若干瓶頸.①?gòu)腄NA片段大小分析,高分子量eDNA取得是從文庫(kù)中捕捉編碼藥品等物質(zhì)完整基因簇先決條件.土壤環(huán)境中,因?yàn)槲⑸锱c土壤顆粒緊密結(jié)合特征以及腐殖酸等抑制性物質(zhì)存在等原因,從中難以取得適于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)高分子量eDNA。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第30頁(yè)至今基于原位裂解取得>100kbp土壤eDNA提取技術(shù)還未突破,利用原位裂解法構(gòu)建更大片段環(huán)境宏基因組文庫(kù)(現(xiàn)有土壤宏基因組文庫(kù)中,平均插入片段最大為44.5kbp)仍是一個(gè)難點(diǎn)。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第31頁(yè)②從DNA所包含信息廣泛度分析,eDNA提取技術(shù)已經(jīng)具備區(qū)分提取樣品中微生物胞外與胞內(nèi)DNA、活細(xì)胞與死細(xì)胞DNA能力,然而,利用現(xiàn)有DNA提取技術(shù)到底能回收環(huán)境中多少類(lèi)型微生物核酸信息仍不清楚。宏基因組技術(shù)在微生物中的應(yīng)用第32頁(yè)不可防止地,環(huán)境宏基因組文庫(kù)所包含微生物基因組信息偏差將直接造成“基因遺漏”現(xiàn)象發(fā)生。如海洋中普遍存在微生物固氮基因,卻