細胞自噬與腫瘤專家講座

細胞自噬與腫瘤細胞自噬與腫瘤專家講座第1頁一、自噬介紹

二、自噬研究方法

三、自噬與腫瘤關系

目錄細胞自噬與腫瘤專家講座第2頁一、自噬介紹1.1自噬過程(1)在饑餓、氧化應激損傷等情況下，自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍；

(2)分隔膜逐步延伸，將要被降解胞漿成份完全包繞形成雙層膜自噬體；

(3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成份，自噬體膜脫落再循環(huán)利用。

細胞自噬與腫瘤專家講座第3頁自噬過程

2.1自噬功效：（1）對外源性刺激適應性反應；（2）細胞保持穩(wěn)定狀態(tài)管家機制；（3）參加一定組織特異性融合；（4）作為一個細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡。細胞自噬與腫瘤專家講座第4頁自噬發(fā)生過程分子機制

細胞自噬與腫瘤專家講座第5頁自噬研究方法

當前普遍采取自噬檢測方法包含電鏡、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡等方法檢測自噬體及其標志蛋白。準確評定自噬不但包含自噬體檢測，還包含動態(tài)觀察整個自噬性降解過程是否順暢(即自噬潮分析)。另外，經(jīng)過藥品或基因干預技術來人為地調(diào)控自噬以觀察其在體內(nèi)體外模型中作用也是自噬分析主要內(nèi)容。

任何一個方法單獨應用均不能作為自噬依據(jù)，不能將自噬體增多降低或自噬相關蛋白表示高低等同于自噬增強或減弱[1]。細胞自噬與腫瘤專家講座第6頁1、自噬性結構電鏡下形態(tài)學觀察

透射電子顯微鏡是觀察自噬現(xiàn)象最直接、最經(jīng)典方法。電鏡檢測自噬主要是基于識別自噬體結構。

電鏡觀察僅能證實自噬性結構存在，難以反應自噬活性強弱。Swanlund等[2]介紹了一個免疫金電鏡技術來對電鏡結果進行定量分析。經(jīng)過圖像分析軟件自動測量全部自噬囊泡面積(μm2)，假如一個細胞胞漿中被自噬性囊泡所占據(jù)總面積增加，則可說明自噬機制上調(diào)。細胞自噬與腫瘤專家講座第7頁細胞自噬與腫瘤專家講座第8頁2、基于自噬體標識蛋白LC3檢測方法

自噬過程由一系列自噬相關蛋白(Atg蛋白)介導完成，這些蛋白質(zhì)在自噬體形成不一樣階段發(fā)揮作用.。細胞內(nèi)存在兩種形式LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。當自噬體形成后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺(PE)偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。LC3-Ⅱ一直穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，所以被用來作為自噬體標識。細胞自噬與腫瘤專家講座第9頁2.1、

細胞免疫熒光LC3-Ⅰ在胞漿內(nèi)彌散分布，LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，經(jīng)過免疫熒光方法檢測內(nèi)源性LC3或轉(zhuǎn)染GFP-LC3融合蛋白表示，自噬誘導后細胞表現(xiàn)為點狀聚集增多。理論上，觀察到點狀聚集數(shù)目即為自噬體數(shù)量，依據(jù)點狀聚集密集程度能夠判斷細胞自噬情況。不過這種方法僅從總體上大致反應自噬增加或降低，定量分析則存在不足。細胞自噬與腫瘤專家講座第10頁

GFP-LC3單熒光自噬指示體系：

綠色斑點增多也并不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解路徑受阻，能夠經(jīng)過westernblot檢測游離GFP、p62來驗證。細胞自噬與腫瘤專家講座第11頁2.2、LC3蛋白轉(zhuǎn)化

試驗自噬發(fā)生后，經(jīng)過Western-blot能夠檢測到兩個條帶蛋白質(zhì)。因為在自噬時細胞內(nèi)LC3蛋白總表示水平其實并無上調(diào)，僅僅是一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變成了LC3-Ⅱ，那么理論上自噬時應表現(xiàn)為LC3-Ⅰ降低和LC3-Ⅱ增加，經(jīng)過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ/(LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ)即可反應自噬水平。細胞自噬與腫瘤專家講座第12頁

不過因為二者反抗體結合能力差異造成檢測敏感性不一樣(LC3-Ⅱ檢測敏感性高于LC3-Ⅰ)，實際檢測結果LC3-Ⅰ降低并不與LC3-Ⅱ增加同時，所以單純比較LC3-Ⅱ蛋白水平可能更加好。細胞自噬與腫瘤專家講座第13頁3、

基于自噬性降解檢測———“自噬潮”分析自噬過程是動態(tài)改變，想要說明細胞自噬活性強弱，必須通觀整個自噬過程是否順利，即經(jīng)過基于自噬性降解自噬潮分析來深入說明自噬活性。

自噬潮涵蓋了自噬體形成、自噬性底物向溶酶體運輸以及在溶酶體內(nèi)降解整個過程。顯然，對這整個過程進行監(jiān)測比單純自噬體檢測更能反應自噬活性，所以“自噬潮”分析是反應自噬活性可靠指標。細胞自噬與腫瘤專家講座第14頁3.1、長壽命蛋白降解依據(jù)自噬機制主要負責降解長壽命蛋白特征，先讓細胞在含有同位素標識氨基酸培養(yǎng)基中生長一段時間，細胞在此期間合成蛋白質(zhì)都將被同位素標識，然后換成不含同位素培養(yǎng)基，讓一些被標識短壽命蛋白經(jīng)過蛋白酶體路徑降解。

在自噬誘導后，經(jīng)過檢測培養(yǎng)基上清中釋放自噬性降解產(chǎn)物放射性活度即可反應細胞自噬性降解能力。細胞自噬與腫瘤專家講座第15頁3.2、LC3和其它自噬性底物降解自噬過程中，自噬體內(nèi)膜上LC3-Ⅱ被溶酶體降解，經(jīng)過免疫印跡監(jiān)測自噬過程中LC3蛋白量改變或流式細胞儀監(jiān)測GFP-LC3熒光強度改變即可反應自噬活性。在自噬誘導一開始，GFP-LC3點狀聚集顯著增多，隨即信號可能會出現(xiàn)下降，代表著自噬性降解發(fā)生。細胞自噬與腫瘤專家講座第16頁3.3、mRFP-GFP-LC3溶酶體呈遞mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系：細胞自噬與腫瘤專家講座第17頁3.4、GFP-LC3切割LC3連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶體降解，但GFP在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號猝滅，GFP本身并不被降解，在自噬性溶酶體降解后會釋放出游離GFP。

經(jīng)過免疫印跡方法檢測游離GFP蛋白出現(xiàn)即意味著自噬性降解發(fā)生。細胞自噬與腫瘤專家講座第18頁4、自噬試驗性調(diào)控經(jīng)過人為干預來激活或者抑制自噬功效后觀察細胞行為或效應分子改變能夠使研究結論更含有說服力。當前，試驗性激活或者抑制自噬方法有藥品處理、自噬基因敲除、緘默或過表示。

慣用自噬激活劑：雷他霉素、營養(yǎng)缺乏、Lithum

慣用自噬抑制劑：3-MA、氯化銨、BafilomycinA1細胞自噬與腫瘤專家講座第19頁自噬與腫瘤關系自噬在腫瘤治療中有雙重作用：作為腫瘤抑制機制，自噬能夠造成細胞死亡、限制細胞數(shù)量，或者降低DNA突變概率，以預防腫瘤形成；作為腫瘤保護機制，自噬能夠保護癌細胞免受化療藥品作用并延緩腫瘤細胞凋亡[3]。

自噬能夠抑制腫瘤，比如葡萄籽原花青素誘導肝癌細胞自噬性死亡[4]，硅膠納米顆粒經(jīng)過活性氧誘導細胞自噬及自噬性死亡[5]。另外，有研究顯示，在各種應激情況下，自噬能夠提升細胞存活[6]。比如，腫瘤進展造成局部缺氧和營養(yǎng)匱乏，此時自噬水平升高以增加腫瘤細胞存活[7]。細胞自噬與腫瘤專家講座第20頁參考文件[1]馬泰,孫國平,李家斌.細胞自噬研究方法[J].生物化學與生物物理進展,,39(3):204-209.[2]ChenN,Karantza-WadsworthV.Roleandregulationofautophagyincancer[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-MolecularCellResearch,,1793(9):1516-1523.[3]石文沽,劉凱,陳德喜,等.自噬與肝癌[J].北京醫(yī)學,,33(12).[4]王威,陳景紅,王新寧,等.葡萄籽原花青素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及自噬性死亡[J].暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版),,32(2).[5]SharmaV,AndersonD,DhawanA.ZincoxidenanoparticlesinduceoxidativeDNAdamageandROS-triggeredmitochondriamediatedapoptosisinhumanlivercells(HepG2)[J].Apoptosis,,17(8):852-870.[6]KroemerG,Mari?oG,LevineB.Autophagyandtheintegratedstressresponse[J].Molecularcell,,4