微生物實驗技術一課件

微生物實驗技術（一）一、顯微鏡技術光學顯微鏡技術普通光學顯微鏡技術相差顯微鏡技術熒光顯微鏡技術電子顯微鏡技術1.普通光學顯微鏡技術

（lightmicroscopy）結構光學放大系統(tǒng)：物鏡（油鏡、高倍鏡和低倍鏡）和目鏡（10×、16×）照明系統(tǒng)：光源、反光鏡和聚光器機械和支架系統(tǒng)2.相差顯微鏡技術

（phase-contrastmicroscopy）相差顯微鏡與普通顯微鏡的區(qū)別：在物鏡后裝有一塊“相差板”，偏轉的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質，使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后這兩組光線經過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，表現(xiàn)出肉眼可見的明暗區(qū)別。相差顯微鏡將光程差或相位差轉換為振幅差，即明暗差別。相差顯微鏡的樣品不需染色，可以觀察活細胞及細胞內的某些細微結構。光線通過不同密度的物質時，其滯留程度也不同，密度大則光的滯留時間長，密度小則滯留時間短。電子顯微鏡與普通光學顯微鏡的基本區(qū)別分辨本領光源透鏡真空成像系統(tǒng)光學顯微鏡200nm可見光玻璃透鏡不要求利用樣品對光的吸收形(λ:400-700nm)成明暗反差和顏色變化100nm紫外光玻璃透鏡不要求(λ約200nm)電子顯微鏡約0.1nm電子束電磁透鏡1.33×10-5~利用樣品對電子的散(λ:0.01~0.9nm)1.33×10-3Pa射和透射形成明暗反差超薄切片技術固定--脫水--包埋--切片--染色固定：要求保持樣品的形態(tài)結構不發(fā)生改變，常用固定劑為戊二醛和鋨酸等，通常在低溫下固定。包埋：使樣品中各種細微結構在切片過程中都得到均勻良好的支撐，使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強度，并能耐受干燥以及觀察時的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂。包埋劑多與水不相溶，所以包埋前要經過一系列脫水處理。切片：厚度通常為40~50nm，常用玻璃刀。染色：用重金屬鹽進行染色以形成明暗反差。樣品中不同成分對染料有不同親和性（脂肪：鋨酸；蛋白質：鉛鹽；核酸：醋酸鈾）負染色技術負染色：利用電子密度比標本高的重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈉等）將生物標本包圍起來，增強背景散射電子的能力以提高反差，在暗的背景下顯示標本的形態(tài)結構。主要用于顆粒狀標本（細菌、病毒、分離的細胞器等）的研究。二、常用的微生物染色法簡單染色法革蘭氏染色法負染色法細菌的觀察方法水浸片（壓滴法）：在載玻片中央滴一滴無菌水，再在其中加入少許菌體，使其均勻分布在無菌水中，蓋上蓋玻片，鏡檢。懸滴法：把要觀察的含菌液體，滴在蓋玻片上，然后把它翻過來，放置在凹孔載玻片上，使液滴懸掛在凹孔室內。染色法：觀察細胞細致形態(tài)和主要構造。1.簡單染色法簡單染色法：只用一種染料處理菌體，適用于一般觀察。涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢革蘭氏染色法革蘭氏染色法：由丹麥醫(yī)生C.Gram于1884年創(chuàng)立，其基本操作分為初染、媒染、脫色和復染四個步驟。甲菌G+

初染媒染

脫色復染結晶紫碘液乙醇沙黃乙菌G-

革蘭氏染色法的原理通過初染和媒染后，在細菌細胞的膜或原生體上染上了不溶于水的結晶紫與碘的大分子復合物。G+細菌由于細胞壁較厚、肽聚糖含量較高和其分子交聯(lián)度較緊密，在用乙醇洗脫時，肽聚糖網孔因脫水而明顯收縮，又由于其基本不含類脂，故在用乙醇處理時不會在壁上溶出縫隙，因此結晶紫與碘復合物仍牢牢阻留在其細胞壁內，呈紫色；G-細菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交聯(lián)松散，用乙醇洗脫時，肽聚糖網孔不易收縮，加上其類脂含量高，乙醇把類脂溶解，在細胞壁上出現(xiàn)較大縫隙，結晶紫與碘復合物極易被溶出細胞壁，因此通過乙醇脫色后，細胞呈無色，再經沙黃等染料復染后呈紅色。負染色法負染色法（莢膜染色法）：用有色背景襯托無色莢膜。三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基：一種人工配制的、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物用的混合養(yǎng)料。因此任何培養(yǎng)基都應具備微生物所需的六大營養(yǎng)要素，且其間的比例是合適的。選用和設計培養(yǎng)基的四個原則：目的明確營養(yǎng)協(xié)調

C/N比=C源中C原子摩爾數(shù)/N源中N原子摩爾數(shù)經濟節(jié)約以粗代精，以“野”代“家”，以廢代好，以簡代繁，以烴代糧，以纖代糖，以氮代朊，以“國”代“進”物理化學條件適宜：pH、滲透壓、水活度選用和設計培養(yǎng)基的四個方法：生態(tài)模擬、查閱文獻、精心設計、試驗比較目的明確培養(yǎng)對象：四大類微生物所需C源、N源、C/N比、生長因子、pH、滲透壓都不同。用途實驗室研究：不必過多地計較其成本一般培養(yǎng)用：天然培養(yǎng)基遺傳代謝或生理研究：合成培養(yǎng)基發(fā)酵生產種子培養(yǎng)基：N源豐富（C/N比低）生產代謝產物含碳的代謝產物：碳源豐富含氮的代謝產物：氮源豐富加入特定元素、特定前體物質pH微生物生長的最適pH值不同。細菌：pH7.0~8.0，放線菌：pH7.5~8.5，酵母菌：pH3.8~6.0，霉菌：pH4.0~5.8微生物生長代謝過程中，會引起培養(yǎng)基pH的變化。糖類發(fā)酵、氧化有機酸有機物脂肪水解有機酸培養(yǎng)基內蛋白質脫羧胺類中性成分(NH4)2SO4NH4+選擇吸收H2SO4無機鹽NaNO3NO3-選擇吸收NaOH加磷酸緩沖液內源調節(jié)調節(jié)加CaCO3或NaHCO3外源調節(jié)：按實際需要流加酸液或堿液*：培養(yǎng)基配好后，先用稀酸或稀堿（10%）調pH.滲透壓（Osmoticpressure）滲透壓：由于溶質濃度差而在細胞膜兩側造成的壓力差。滲透壓的大小與溶液中分子或離子的質點數(shù)有關。等重的物質，其分子或離子越小，則質點數(shù)越多，滲透壓越大。低滲溶液：外界濃度低，細胞吸水膨脹。等滲溶液：適宜微生物生長。高滲溶液：外界濃度高，細胞失水，發(fā)生質壁分離。水活度aw水活度aw：表示在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水的含量。自由水：微生物可利用。 細胞內水分狀態(tài)結合水：微生物不能利用。 aw定量：在相同溫度和壓力下，某溶液的蒸汽壓P與純水蒸汽壓P0之比，也等于溶液的百分相對濕度。 aw=P/P0=ERH/100 純水：aw=1，無水：aw=0，∴0<aw<1 各種微生物生長繁殖的aw值范圍：0.998~0.6培養(yǎng)基的種類根據(jù)培養(yǎng)基的成分分：天然培養(yǎng)基（complexmedium或undefinedmedium）：利用動植物或微生物或其提取物制成的培養(yǎng)基，人們無法確切知道其中的成分。如：培養(yǎng)細菌的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基、培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基。組合培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基）（definedmedium）：一類用多種高純化學試劑配制成的、各成分的量都確切知道的培養(yǎng)基。如：培養(yǎng)放線菌的高氏一號培養(yǎng)基、培養(yǎng)霉菌的察氏培養(yǎng)基。半組合培養(yǎng)基（semi-definedmedium）：既含有天然成分又含有純化學試劑的培養(yǎng)基。如：培養(yǎng)真菌的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)分：液體培養(yǎng)基（liquidmedium）半固體培養(yǎng)基（semi-solidmedium）：液體培養(yǎng)基+0.2~0.5%瓊脂固體培養(yǎng)基（solidmedium）：凝固培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+1.5~2%瓊脂（5~12%明膠）非可逆性凝固培養(yǎng)基：用血清或硅膠作凝固劑天然固體培養(yǎng)基：用麩皮、米糠、木屑等配制而成。根據(jù)培養(yǎng)基功能分：選擇性培養(yǎng)基（selectedmedium）：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學物理因素的抗性而設計的培養(yǎng)基，其功能是使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該菌的篩選效率。方法：投其所好，取其所抗。鑒別性培養(yǎng)基（differentialmedium）：培養(yǎng)基中加有能與某一菌的無色代謝產物發(fā)生顯色反應的指示劑，從而用肉眼就能使該菌菌落與外形相似的它種菌落相區(qū)分的培養(yǎng)基。如：伊紅美藍乳糖培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）——鑒別腸道菌。滅菌與消毒滅菌：采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物（包括病原微生物和非病原微生物）永遠喪失其生長繁殖能力的措施。消毒：采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。如：巴氏消毒法防腐：利用某種理化因素（低溫、缺氧、干燥、高滲、高酸度、防腐劑）完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。干熱滅菌法原理：高溫使微生物細胞內的蛋白質和核酸等生物大分子發(fā)生變性、破壞。細胞內蛋白質的凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。在濕熱條件下，菌體吸收水分，蛋白質易凝固；濕熱的穿透力比干熱大；濕熱的蒸汽有潛熱存在。1克水在100℃時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出2.26KJ的熱量?；鹧孀茻ǎ褐苯釉诨鹧嫔献茻郎缇?。適用范圍：接種針（環(huán)），試管口，三角瓶口，金屬小工具。烘箱內熱空氣滅菌法：160℃2h，適用于耐高溫器皿。注意：溫度不可超過180℃，超過180℃，玻璃器皿上的棉塞及外面包的紙張均會被烤焦著火。由于熱空氣穿透力弱，滅菌時物品不宜堆放得太緊。降溫要緩慢，以免玻璃破裂，待溫度＜60℃時，方可打開箱門。濕熱滅菌法煮沸消毒法：一般用于飲用水的消毒，100℃15min以上。間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基。

80~100℃15~60min室溫或37℃過夜巴氏消毒法（Pasteurization）高壓蒸汽滅菌法（Autoclave）重復三次培養(yǎng)基徹底滅菌巴氏消毒法（Pasteurization）目的：殺死無芽孢的病原菌（如牛奶中的結核桿菌或沙門氏菌），不影響食品風味。方式低溫維持法（LTH）：63-66oC,30min高溫瞬時法（HTST）：72oC,15sec用途：用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法。高壓蒸汽滅菌法（Autoclave）儀器：高壓蒸汽滅菌鍋1.05kg/cm2或15磅/英寸2，即121oC，15-20min注意事項：滅菌前應先排盡鍋內空氣影響加壓蒸汽滅菌的因素滅菌物體的含菌量：含菌量↑，滅菌時間↑滅菌對象的pH：pH<6，微生物易死亡；pH6.0~8.0，微生物不易死亡滅菌對象的體積：影響熱傳導率加熱與散熱速度滅菌鍋內空氣排除程度的影響：加壓蒸汽滅菌不是靠蒸汽壓力，而是靠蒸汽溫度，滅菌時要先排盡鍋內空氣，否則壓力表上壓力=鍋內水蒸汽壓力+空氣壓力↓↓壓力表上溫度鍋內溫度滅菌物體含菌量的影響芽孢數(shù)目和滅菌時間的關系芽孢數(shù)/ml在100℃下殺菌時間（分）10000000019750000001650000000142500000012100000081000006pH對滅菌時間的影響溫度芽孢數(shù)滅菌時間（分）（℃）（個/ml）pH6.1pH5.3pH5.0pH4.7pH4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150滅菌對象體積的影響不同容量的液體的滅菌時間容器（ml）在121~123℃下所需滅菌時間（分）三角燒瓶5012~1420012~1550017~22100020~25200030~35血清瓶900050~55空氣排除度對滅菌溫度的影響壓力表讀數(shù)鍋內溫度（℃）kg/cm2磅/英寸2純蒸汽排除1/2空氣不排除空氣0.35510994720.7010115105901.05151211121001.40201261181091.75251301241152.1030134128121高溫對培養(yǎng)基成分的影響形成沉淀物牛肉膏、蛋白胨、麥芽汁等天然培養(yǎng)基滅菌后，發(fā)生沉淀。（一般不影響微生物生長）培養(yǎng)基中含Ca、Mg、Fe、Zn等離子，加熱后易形成磷酸鹽、碳酸鹽沉淀。破壞營養(yǎng)，提高色澤褐變：含糖較高的培養(yǎng)基滅菌后，顏色發(fā)生變化，如黃、褐色，一般顏色越深，發(fā)酵效果越差。原因：還原糖的羰基與氨基酸或蛋白質的氨基反應→氨基糖（褐色）；部份糖分解→焦糖改變培養(yǎng)基pH：滅菌后，培養(yǎng)基pH下降0.2~0.3降低培養(yǎng)基濃度：氣溫低時會增加冷凝水滅菌溫度和時間對營養(yǎng)成分破壞的影響滅菌溫度（℃）滅菌時間（分）營養(yǎng)成分的破壞（%）10040099.3110306711515501204271300.581400.08