遺傳工程動(dòng)物專家講座

1第十三章遺傳工程動(dòng)物遺傳工程動(dòng)物專家講座第1頁2第一節(jié)概述第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)發(fā)展概況第三節(jié)遺傳工程動(dòng)物制備方法第四節(jié)遺傳工程動(dòng)物建系和保種第五節(jié)遺傳工程動(dòng)物應(yīng)用遺傳工程動(dòng)物專家講座第2頁3第一節(jié)概述

概念基因（Gene）：位于染色體上含有遺傳效應(yīng)DNA片斷。三類：

1.編碼蛋白質(zhì)：DNAmRNAProtein2.編碼RNA：DNArRNA&tRNA3.調(diào)控序列基因組（Genome）：儲(chǔ)存有生物體內(nèi)全部遺傳信息全套染色體，稱之為基因組。外源基因（ForeigngeneorTransgene）：外來、非本身基因成份。遺傳工程動(dòng)物專家講座第3頁4基因型：生物所含有基因成份，叫基因型（Genotype)表現(xiàn)型：生物所顯示遺傳性狀，叫表現(xiàn)型（Phenotype)純合子：一對等位基因彼此相同，叫純合子（Homozygote)雜合子：一對等位基因彼此不一樣，叫雜合子（Heterozygote)半合子：一條染色體上增加了一個(gè)外源基因，叫半合子（Semizygote)遺傳工程動(dòng)物專家講座第4頁5外源基因構(gòu)件（construct）:將外源基因片段經(jīng)過分子生物學(xué)方法組合起來，以到達(dá)設(shè)計(jì)目標(biāo)。這種重組DNA片段稱為外源基因構(gòu)件。載體（vector）：帶有宿主DNA序列外源基因構(gòu)件稱為載體。它起著將外源基因構(gòu)件帶到特定位置作用。遺傳工程動(dòng)物專家講座第5頁6遺傳工程動(dòng)物定義

遺傳工程動(dòng)物（GeneticallyengineeredAnimals）是指將外源基因或經(jīng)改造本身基因片段導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或早期胚胎，使之穩(wěn)定整合于宿主染色體基因組內(nèi)，并能遺傳給后代一類動(dòng)物。

遺傳工程動(dòng)物亦有稱為基因修飾動(dòng)物（Genemodifiedanimals)。

遺傳工程動(dòng)物包含全部用遺傳工程技術(shù)制備動(dòng)物，但有時(shí)人們常把“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”泛指為“遺傳工程動(dòng)物”。狹義轉(zhuǎn)基因動(dòng)物普通僅指用顯微注射法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備，即“加入”一個(gè)外源基因動(dòng)物。遺傳工程動(dòng)物專家講座第6頁7遺傳工程動(dòng)物分類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（Transgenicanimals)：

加入一個(gè)外源基因基因敲除動(dòng)物(Geneknockoutanimals)：

使一個(gè)基因功效失活基因敲入動(dòng)物(Geneknockinanimals)：

加入或替換一個(gè)基因染色體工程動(dòng)物(Chromosomeengineeredanimals)：使染色體片斷缺失、易位、倒置、

重復(fù)遺傳工程動(dòng)物專家講座第7頁8轉(zhuǎn)基因和基因敲除疾病相關(guān)或功效未知基因功效取得“加法”

“減法”功效缺失?遺傳工程動(dòng)物專家講座第8頁91980年，Gordon等把HSV-tk基因顯微注射到小鼠受精卵原核中，取得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠，創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因方法。1982年P(guān)almiter等將大鼠生長素基因和牛生長素基因分別注射到小白鼠受精卵中，得到了體型巨大“超級小鼠”。第二節(jié)遺傳工程動(dòng)物技術(shù)發(fā)展概況遺傳工程動(dòng)物專家講座第9頁101985年Smithies等首先在β球蛋白位點(diǎn)上進(jìn)行基因打靶，取得基因敲除小鼠。1987年英國Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因綿羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高達(dá)30mg/L。1995年Ramirez-Solis等首先制作成功染色體重排小鼠。年McCreath等用體細(xì)胞基因打靶取得轉(zhuǎn)基因綿羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高達(dá)650ugml。1994年Kim等創(chuàng)造鋅指核酶（Zinc-fingernucleases，ZFN）技術(shù)，已經(jīng)被成功用于好幾個(gè)不一樣系統(tǒng)，如小鼠細(xì)胞、人類細(xì)胞、斑馬魚、植物、果蠅、大鼠等進(jìn)行基因敲除。遺傳工程動(dòng)物專家講座第10頁11一、用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（一）原理將帶有完整序列外源基因構(gòu)件經(jīng)過顯微注射注入到受精卵雄性原核中，外源基因隨機(jī)插入并整合到染色體上任意序列中。將顯微注射后受精卵經(jīng)體外培養(yǎng)，移植到假孕動(dòng)物輸卵管內(nèi)。子代出生后用分子生物學(xué)方法判定，確認(rèn)整合有外源基因動(dòng)物即為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第三節(jié)遺傳工程動(dòng)物制備方法遺傳工程動(dòng)物專家講座第11頁12（二）步驟1.制備外源目標(biāo)基因構(gòu)件外源基因構(gòu)件必須包含：開啟子、外源基因編碼區(qū)、PolyA（終止）信號(hào)開啟子組織特異性決定了外源基因表示時(shí)空特異性：開啟子表示組織CMV各種組織WAP乳腺β-Lactoglobulin乳腺Albuminenhancer肝臟αmyosinheavychain心臟遺傳工程動(dòng)物專家講座第12頁13用內(nèi)切酶將基因片段切下來備用遺傳工程動(dòng)物專家講座第13頁142.動(dòng)物準(zhǔn)備1）供受精卵雌鼠：提供受精卵用于顯微注射2）正常雄鼠：與供受精卵雌鼠交配產(chǎn)生受精卵3）受體（假孕）雌鼠：顯微注射后胚胎移植受體。為了使子宮內(nèi)膜改變與胚胎著床同時(shí)，需要與結(jié)扎雄鼠交配4）結(jié)扎雄鼠：因輸精管結(jié)扎，不會(huì)排精。與雌鼠交配，產(chǎn)生受體（假孕）雌鼠，不會(huì)受孕，但可使雌鼠黃體活化，維持妊娠狀態(tài)。遺傳工程動(dòng)物專家講座第14頁15鼠類供受精卵鼠正常雄鼠受體雌鼠結(jié)扎雄鼠鼠齡4～6周＞8周＞8周＞8周體重＞15克＞22克＞25克＞25克作用受精卵供體與供體雌鼠交配注射卵移植受體與受體雌鼠交配更換頻率每次普通6～8個(gè)月每次普通6～8個(gè)月飼養(yǎng)每籠3～5只每籠1只1～3只與結(jié)扎雄鼠合籠每籠1只備注產(chǎn)過仔很好結(jié)扎后兩周用轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)需用各類小鼠遺傳工程動(dòng)物專家講座第15頁163.顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物步驟♂

♀

外源基因判定方法：PCRSouthern結(jié)扎公鼠成年雌鼠假孕雌鼠DNA構(gòu)件遺傳工程動(dòng)物專家講座第16頁17超數(shù)排卵雌鼠10只有陰栓雌鼠數(shù)6～8只取得受精卵數(shù)200～300個(gè)可注射雄性原核卵數(shù)150～250個(gè)顯微注射后存活卵數(shù)100～200個(gè)每個(gè)受體移卵數(shù)20～40個(gè)受體數(shù)3～6只超數(shù)排卵與轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)遺傳工程動(dòng)物專家講座第17頁18顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遺傳工程動(dòng)物專家講座第18頁19顯微注射法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法經(jīng)典，簡便、可靠缺點(diǎn)：顯微注射整合率低，只有5%。只能加入基因，不能剔除或原位修飾。整合是隨機(jī)，因?yàn)椴迦胛稽c(diǎn)關(guān)系，轉(zhuǎn)基因表示有不確定性，有高，有低。因?yàn)槭请S機(jī)整合，可能破壞主要內(nèi)源性DNA序列或激活細(xì)胞致癌基因。用原核顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物經(jīng)常是嵌合體，即并不是全部細(xì)胞都整合有外源基因。不能在胚胎早期確定性別。遺傳工程動(dòng)物專家講座第19頁20二、逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（一）原理逆轉(zhuǎn)錄病毒是一類含有逆轉(zhuǎn)錄酶RNA病毒，能將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，進(jìn)而整合到細(xì)胞染色體DNA中。利用這個(gè)特點(diǎn)，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒改造成外源基因表示載體，用于基因治療研究和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒科有三個(gè)亞科：

RNA腫瘤病毒亞科慢病毒亞科泡沫病毒亞科遺傳工程動(dòng)物專家講座第20頁21逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)LTR:Longterminalrepeat，在5‘末端含有開啟子/調(diào)控序列作用，在3’末端含有polyA信號(hào)作用。ψ+：病毒包裝信號(hào)，含有指導(dǎo)病毒RNA包裝成病毒顆粒功效。Gag：編碼核衣殼、衣殼和基質(zhì)功效。pol：編碼整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。env：編碼包膜表面糖蛋白和轉(zhuǎn)膜蛋白。dsDNAmRNAProtein生物正常遺傳信息流遺傳工程動(dòng)物專家講座第21頁22（二）用逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本步驟構(gòu)建病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞搜集病毒顆粒感染受精卵胚胎移植表示gag,pol,env

細(xì)胞遺傳工程動(dòng)物專家講座第22頁23逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因效率高單位點(diǎn)、單拷貝整合

缺點(diǎn)隨機(jī)整合攜帶外源DNA片段大小受限，普通小于10kb易產(chǎn)生嵌合體（mosaic)遺傳工程動(dòng)物專家講座第23頁24三、ES細(xì)胞法介導(dǎo)基因敲除小鼠制備（一）原理

將ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后，用經(jīng)過改造外源基因打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞水平用正負(fù)篩選法篩選外源基因定點(diǎn)整合ES細(xì)胞株。將外源基因定點(diǎn)整合ES細(xì)胞注入到囊胚期胚胎囊胚腔內(nèi)，在體外短暫培養(yǎng)后，移植到假孕小鼠子宮內(nèi)。出生小鼠為ES細(xì)胞起源品系和囊胚供體品系之間嵌合體。外源基因能否傳給下一代取決于ES細(xì)胞在嵌合體動(dòng)物中嵌合程度，嵌合程度越高，ES細(xì)胞在嵌合體動(dòng)物中分化成生殖細(xì)胞可能性就越大。遺傳工程動(dòng)物專家講座第24頁25基因打靶載體構(gòu)建1）載體兩端有同源臂；2）外源基因；3）要有正負(fù)篩選基因正篩選：Neor基因（用G418篩選，殺死未整合細(xì)胞）負(fù)篩選：tk基因（用Ganc篩選，殺死隨機(jī)整合細(xì)胞）tktk5’同源臂3’同源臂Neor圖11-2打靶載體構(gòu)建示意圖遺傳工程動(dòng)物專家講座第25頁26同源臂同源臂外源基因Tk基因定點(diǎn)整合隨機(jī)插入ES細(xì)胞正常細(xì)胞G418+Ganc培養(yǎng)液2.將打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞內(nèi)遺傳工程動(dòng)物專家講座第26頁27正負(fù)篩選出來ES細(xì)胞是否是我們想要定點(diǎn)整合細(xì)胞，需要用分子生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行判定。Southernblot試驗(yàn)PCR遺傳工程動(dòng)物專家講座第27頁283.用ES細(xì)胞介導(dǎo)法制作基因敲除小鼠♂♀PCRSouthern結(jié)扎公鼠成年雌鼠假孕雌鼠導(dǎo)入基因ES細(xì)胞遺傳工程動(dòng)物專家講座第28頁29將經(jīng)篩選外源基因定點(diǎn)整合ES細(xì)胞注射到囊胚內(nèi)遺傳工程動(dòng)物專家講座第29頁304.基因敲除小鼠建系♂嵌合體♀野生型雜合子雜合子1/4純合子遺傳工程動(dòng)物專家講座第30頁31因?yàn)槌Ｒ?guī)ES細(xì)胞注入到2倍體囊胚取得ES細(xì)胞遺傳背景子代需要經(jīng)過嵌合體階段，使得研究成本昂貴，研發(fā)周期長。近年來發(fā)展四倍體賠償技術(shù)能夠繞過嵌合體小鼠階段，直接取得ES細(xì)胞遺傳背景小鼠。其方法是：將受體2細(xì)胞胚胎用電融合方法取得四倍體胚胎。培養(yǎng)到囊胚階段后，將ES細(xì)胞注射到囊胚內(nèi)，經(jīng)短暫體外培養(yǎng)后將它移植于假孕第2天小鼠子宮中。出生子代全都是ES細(xì)胞遺傳背景。其基本原理是四倍體胚胎含有顯著胚外組織限制性分布，基本不參加胎兒及胚外中胚層組織發(fā)育。四倍體賠償技術(shù)能顯著縮短基因修飾小鼠研發(fā)，直接得到近交遺傳背景動(dòng)物，大大降低了研發(fā)成本，含有顯著技術(shù)優(yōu)勢。遺傳工程動(dòng)物專家講座第31頁32傳統(tǒng)技術(shù)最新四倍體賠償技術(shù)2細(xì)胞胚胎四倍體胚胎發(fā)育到囊胚囊胚內(nèi)注入突變ES細(xì)胞胚胎移植ES細(xì)胞遺傳背景雜合子電融合確定交配3.5天取囊胚囊胚內(nèi)注入突變ES細(xì)胞胚胎移植ES細(xì)胞和囊胚起源嵌合體嵌合體×野生型雜合子遺傳工程動(dòng)物專家講座第32頁33ES細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)能在細(xì)胞水平進(jìn)行篩選。能加入、剔除或替換某個(gè)基因，或進(jìn)行小到一個(gè)或幾個(gè)核苷酸修飾。缺點(diǎn)ES細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻、技術(shù)要求高，成本大。不一樣ES細(xì)胞株生殖系傳輸能力差異很大。ES介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因需要經(jīng)過嵌合體這一中間步驟。遺傳工程動(dòng)物專家講座第33頁34第四節(jié)遺傳工程動(dòng)物建系和保種一、遺傳工程小鼠建系過程中交配方式遺傳工程小鼠建系目標(biāo)是使外源基因能夠穩(wěn)定地遺傳給后代。轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)入外源基因能夠在半合子狀態(tài)表示，但表示程度因整合位點(diǎn)不一樣有所差異。因?yàn)橛蔑@微注射法和逆轉(zhuǎn)錄病毒制備轉(zhuǎn)基因都是隨機(jī)整合，用同一基因構(gòu)件取得數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)基因G0代小鼠可能整合位點(diǎn)各不相同，且有可能多位點(diǎn)整合，所以G0代小鼠應(yīng)該單獨(dú)與該品系野生型進(jìn)行交配，而不應(yīng)在不一樣G0代小鼠之間交配。遺傳工程動(dòng)物專家講座第34頁35基因敲除小鼠因?yàn)樵贓S細(xì)胞內(nèi)用同源重組方法普通僅滅活一個(gè)位點(diǎn)，依據(jù)孟德爾遺傳法則，同源染色體一對等位基因中一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生滅活，其基因功效由等位基因另一個(gè)位點(diǎn)代替，從而不表現(xiàn)任何突變形狀。只有當(dāng)一對等位基因兩個(gè)位點(diǎn)都滅活，即純合子，才表現(xiàn)出基因敲除性狀。純合子小鼠即是我們所希望得到基因敲除小鼠。當(dāng)前用ES細(xì)胞大多來自129品系，其嵌合體普通與野生型C57BL/6回交。經(jīng)過6代回交后，其遺傳背景將是C57BL/6了。此時(shí)任何遺傳背景對基因表示影響將可經(jīng)過與正常C57BL/6小鼠比較而得到控制。遺傳工程動(dòng)物專家講座第35頁36二、遺傳工程小鼠品系維持遺傳工程小鼠品系是以半（雜）合子狀態(tài)還是以純合子狀態(tài)維持好呢？從理論上講以純合子狀態(tài)喂養(yǎng)繁殖最理想，因?yàn)榻⒘思兒献悠废稻湍芊€(wěn)定遺傳，無須每一代都進(jìn)行基因型檢測。但因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠外源基因有可能是多位點(diǎn)整合，要建立純合子品系就必須對多位點(diǎn)整合G0代小鼠每個(gè)整合位點(diǎn)進(jìn)行分離，形成單位點(diǎn)穩(wěn)定遺傳純合子品系。在以下情況下必須以雜合子狀態(tài)維持：①所研究靶基因突變是致死，純合子可能在胚胎期或出生后早期死亡，或性成熟前死亡；②純合子小鼠不育。此時(shí)需要對每一代全部子代進(jìn)行檢測來確定基因型，因而工作量較大。應(yīng)用條件性基因打靶技術(shù)是防止致死性突變最有效路徑。遺傳工程動(dòng)物專家講座第36頁37轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜合子保種方法G0代整合檢測+：雜合子外源基因檢測野生型×+：雜合子野生型×+：雜合子野生型×未整合：棄去+：雜合子野生型×+：雜合子野生型×用于試驗(yàn)外源基因檢測外源基因檢測外源基因檢測外源基因檢測遺傳工程動(dòng)物專家講座第37頁38G0代整合檢測-：棄去+：雜合子×野生型G1代-：棄去+：雜合子×雜合子-：棄去+：純合子G2代基因型、表型檢測純合子繁殖遺傳工程動(dòng)物建系和純合子保種方法遺傳工程動(dòng)物專家講座第38頁39遺傳工程動(dòng)物專家講座第39頁40第五節(jié)遺傳工程動(dòng)物應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里基礎(chǔ)性研究醫(yī)學(xué)研究人類疾病動(dòng)物模型基因治療模型3.畜牧業(yè)上品種改良4.乳腺生物反應(yīng)器5.異種器官移植供體遺傳工程動(dòng)物專家講座第40頁41遺傳工程小鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中

應(yīng)用例子介紹遺傳工程動(dòng)物專家講座第41頁42骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）含有多分化潛能，在不一樣調(diào)控因子作用下能夠向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等方向分化。Cbfa1可于轉(zhuǎn)錄水平使MSCs定向分化為成骨細(xì)胞，也可使軟骨細(xì)胞肥大化，進(jìn)而促進(jìn)軟骨內(nèi)化骨.小鼠成骨細(xì)胞特異過表示Cbfa1造成骨基質(zhì)形成降低，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，表明Cbfa1在骨發(fā)育后骨形成過程中也起作用。Cbfa1轉(zhuǎn)基因小鼠遺傳工程動(dòng)物專家講座第42頁43Plag1PLAG1Transgene18SPLAG1Transgene18SHeartLiverSpleenLungKidneyBrainS.IntetineS.MuscleSa.GlandTestesEpididymisSe.GlandM.Gland人多形性腺瘤基因（PLAG1）轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生自發(fā)多形性腺瘤InternationalJournalofCancer;118(3):643-648.

PLAG1編碼一個(gè)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,體外研究表明其異位表示往唾液腺多形性腺瘤發(fā)生起主要作用。遺傳工程動(dòng)物專家講座第43頁44OPG（骨保護(hù)素）基因剔除小鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松ProgressinBiochemistryandBiophysics,34(3):260-266.

+/++/--/-骨保護(hù)素（OPG）是近年發(fā)覺一個(gè)抑制破骨細(xì)胞生成蛋白質(zhì)，含有潛在抗骨質(zhì)疏松作用。骨保護(hù)素缺失小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重骨質(zhì)疏松癥，骨密度減低，破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加，骨轉(zhuǎn)換率加緊，遺傳工程動(dòng)物專家講座第44頁45Rig-I基因剔除造成小鼠抗細(xì)菌免疫功效障礙Genotypewt+/--/-Sex♂♀total♂♀total♂♀totaln494897395190395089Eyeinfection000000101525%00000025.63028.1Skininfection101011437%