葉綠素實驗報告

葉綠素銅鈉的合成、分離、分析及結(jié)構(gòu)測定食品092一、實驗?zāi)康模?、從蠶沙中提取葉綠素并計算提取率。2、初步研究葉綠素合成葉綠素銅鈉的工藝條件。3、分析葉綠素銅鈉產(chǎn)品的純度并計算其產(chǎn)率。4、通過試驗提高綜合能力及練習(xí)鞏固各種相關(guān)操作。二、產(chǎn)品驗收指標(biāo)項目和指標(biāo)1項目1指標(biāo)11pH|9.0?10.71%|E405nmN|1cm|568消光比值|3.2?4.0總銅(Cu),%|4.0?6.0游離銅(Cu),%W|0.025神(As),%W||0.0002鉛(Pb),%W||0.0005干燥失重，%W|4.0硫酸灰分，%W|36.01三、實驗原理：葉綠素是一種含有卟吩環(huán)的天然色素，它與蛋白質(zhì)結(jié)合存在于植物的綠葉和綠色的莖中，是植物進行光合作用所必須的催化劑，葉綠素難溶于水，而易溶于極性有機溶劑。葉綠素有a和b兩種，a為藍黑色結(jié)品葉綠素是一種含有卟吩環(huán)的天然色素，在葉綠素的結(jié)構(gòu)中，含有一個由四個毗咯環(huán)和四個次甲基交替相聯(lián)形成的卟吩環(huán).卟吩環(huán)閉合的共軛體系提供了包圍鎂離子(或其它相似離子)的剛性平面.葉綠素的結(jié)構(gòu)如圖l所示：

TOC\o"1-5"\h\zY：CH,，CjoH^：葉綠醇基,Y：CHO'CjoH^：葉綠醇基.,葉綠素H?葉綠素'Ca(CH3)2a<CH2CH2<CH2—CH—CH2—CH,C=CH—CH2?CH3ch3圖1,葉綠素H?葉綠素'蠶沙中含有豐富的葉綠素，其純含量達0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蠶沙來提取葉綠素，由于葉綠素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶劑，故可用乙醇、丙酮混合液來提取。所得的葉綠素由于遇熱、光、酸、堿等易分解，且又不溶于水。110度左右會分解，故把葉綠素制備成葉綠素銅鈉，其性質(zhì)更穩(wěn)定溶解性也會有所提高。葉綠素分子中的鎂原子和四個毗咯上的氮原子相結(jié)合，環(huán)上是雙羧酸的酯，一個被四所酯化，另一個被葉醇基所酯化，故可以發(fā)生皂化反應(yīng)生成鈉鹽：CHONMg+2NaOH=CHONMgNa+CHOH+C5572543430542320HOH3CHONMg+2NaOH=CHONMgNa+CHOH+C5570643428642320HOH39在酸性條件下，葉綠素鈉鹽分子中的鎂極易被氫原子取代生成褐色的葉綠酸：CHONMgNa+4H+=CHON+Mg2++2Na+TOC\o"1-5"\h\z3430542343454。葉綠酸可與銅鹽在加2熱條件下生成葉綠素銅酸析出，將葉綠素銅酸溶于丙酮，再與堿反應(yīng)生成葉綠素銅鈉：CHON+Cu2+=CHONCu+2H+343454343254CHON+Cu2+=CHONCu+2H+343264343064CHONCu+2NaOH=CHONCuNa+2HO34325434305422CHONCu+2NaOH=CHONCuNa+2HO34306434286422蠶糞葉綠素銅鈉鹽的光譜特性蠶糞葉綠素銅鈉鹽水溶液在360~700之間有2個吸收峰在波長440處有一最大吸收峰，其吸光度為114;在630處有一較小的吸收峰，其吸光度為017〃在波長440的吸收峰為葉綠素銅鈉鹽特有，而在630處的

吸收峰為葉綠素特有，葉綠素銅鈉鹽的含量約是蠶糞中葉綠素含量的2倍，所以試驗中均采用440的波長測定葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性。下圖是蠶糞葉綠素銅鈉鹽的光譜特性⑸。1、蠶沙（50克）^%召啪5%乙醇4女3、、將埋溶誰I。&珞稀鹽酸5、丙酮6、石油醚7、CuSO溶液8、蒸餾水9、40%乙醇（純乙醇與蒸餾水按2:3配）10、5%N^OH-乙醇溶液11、pH試紙12、磷酸鹽緩沖（二；"儀部取°?譬蚪磷酸氫二鈉心的磷酸氫二鉀以對：4混合A、葉綠素的提取葉綠素銅鈉合成1、溫度計1支回流冷凝管1支500ml圓底燒瓶1個恒溫槽1臺濾瓶及漏斗1個膠頭膠管1個玻璃棒1支100mL量筒1個鐵架臺1臺電熱恒溫水浴裝置1套2、減壓蒸餾裝置1臺3、臺氏天平1臺4、PH試紙若干B、葉綠素銅鈉質(zhì)量分析1、751分光光度計1臺2、臺式天平、分析天平各1臺膠頭滴管100mL、50mL容量瓶吸耳球一個1支膠頭滴管100mL、50mL容量瓶吸耳球一個1支各1個10mL、50mL量筒各一個25mL、1mL吸量管各一支4、試紙若干五、實驗步驟（一）葉綠素銅鈉的合成1、葉綠素的提?。海?）在500ml圓底燒瓶中，先加入50g十蠶沙，再加入95%乙醇100ml。（2）將反應(yīng)瓶用水浴加熱，使水浴溫度在60°C（防止葉綠素a和b分解），浸泡提取2小時，濾出提取液。（3）按步驟2用乙醇重復(fù)2次。（4）合并3次提取液，在減壓、不超過60攝氏度下蒸出乙醇。趁熱傾出瓶中液體，冷卻全室溫，得到墨綠色膏狀物（葉綠素粗品，不宜久置）。2、皂化:將濃縮液置于帶攪拌子三口燒瓶中，用5%NaOH-CHOH溶液調(diào)節(jié)使其pH=11，用25水浴加熱在60°C下皂化回流1小時。3、萃取:將皂化液冷卻后轉(zhuǎn)入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去雜質(zhì)（黃色）靜置分層，下層為可溶性葉綠酸鹽（綠色），取上層液檢驗是否完全皂化：取上層液少許置于小燒杯中，加入2—3倍石油醚靜置，用玻棒沾取上層液去試紙上，呈綠色則不完全皂化。取下層溶液，上層溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)回收石油醚。平行萃取3次。4、調(diào)酸銅代：將下層溶液裝入三口燒瓶中，往其中慢慢加入稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=7后，加入10%的硫酸銅10ml，攪拌均勻后，再用鹽酸將溶液調(diào)節(jié)pH為2-3，在水浴60C下保溫攪拌1小時。趁熱過濾，用95%乙醇洗滌3次后抽干。合并濾液和洗液，加入4倍的蒸餾水，析出葉綠素銅，靜置過夜后過濾，濾餅依次用適量的純水、40%乙醇及石油醚洗滌3次至石油醚層變?yōu)闇\綠色，以除去其中的H+、（7及殘留的葉黃素和其他有機雜質(zhì)。5、成鹽：洗滌結(jié)束后濾十，濾餅用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH=11，攪拌，成鹽（用濾紙法檢驗成鹽情況：用玻棒點少許溶液放在濾紙上，濾紙不顯綠色則說明完全成鹽），將其在60C下加熱蒸發(fā)以除去水分得墨綠色結(jié)品物，然后再在60C下烘箱中烘干結(jié)品物，即制得墨綠色光澤的成品（略有胺味）。流程圖：溶劑NaOH溶液不皂化物溶劑酸CuSO4溶液濾渣!!t!!!!蠶砂一預(yù)處理一浸提一皂化一分離一萃取一調(diào)pH值一銅化一過濾一蠶砂水!稀酒精!NaOH!-離析-沉淀-烘干-純化-成鹽-過濾—干燥—成品（二）、純度分析：1、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01克（精確至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。準(zhǔn)確取1mL溶液以pH=7.5磷酸鹽緩沖液定容為100mL,搖勻，即為0.001%溶液，用分光光度計測定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長處測定吸光值（A），以緩沖液作空白對照。類似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度計測定，在15分鐘內(nèi)用1cm的比色杯，在405nm波長處測定它們的吸光值（A），以緩沖液作空白對照，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽的吸收曲線稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01克（精確至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。準(zhǔn)確取1mL溶液以pH=7.5磷酸鹽緩沖液定容為100mL，搖勻，即為0.001%溶液，此液最大吸收峰為405nm與630nm，吸光比入405皿/土3加為3.2?4.0。用分光光度計測定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波長處測定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測定一次），以緩沖液作空白對照，并繪制吸收曲線。3、產(chǎn)品葉綠素銅鈉鹽的吸光比測定稱取烘干成品0.01克（精確至0.0002克），加水溶解，移入10mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。從容量瓶中準(zhǔn)確取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸鹽緩沖液定容至刻度，搖勻，即為0.004%溶液，此液最大吸收峰為405nm與630nm。用分光光度計測定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波長處測定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測定一次），以緩沖液作空白對照，并繪制吸收曲線。六、實驗現(xiàn)象試驗操作試驗現(xiàn)象備注稱取蠶沙50g墨綠色加入去離子水浸潤和95%乙醇60°C攪拌回流2h蠶沙部分溶解抽濾，保存濾液得到呈墨綠色的液體剩余蠶沙用95%乙醇再次回流2次抽濾，混合三份濾液得到呈墨綠色的液體提高產(chǎn)率水浴，減壓蒸餾，把合并濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，并在55C水浴中加熱蒸餾回收95%乙醇得約50mL左右溶液，溶液成糊狀，蒸發(fā)液呈無色防止污染循環(huán)利用在濃縮液中加5%NaOH-乙醇調(diào)PH值到11，在溫度為60C，皂化時為1h溶液出現(xiàn)小氣泡皂化過程皂化后，并洗滌加HCl調(diào)，PH=7加入10%CuSO調(diào)PH=2-—3，在攪拌下溫度60C，保持1h左右PH試紙變紅色此時慢慢出現(xiàn)膠狀墨色懸浮物葉綠素銅酸

趁熱過濾，濾渣先用水洗去，再用95%乙醇洗滌3次后抽十。合并濾液和洗液，加入4倍的蒸餾水，靜置過夜后過濾得墨綠色物質(zhì)洗滌液呈綠色固體溶解得綠色液體得墨綠色粉末葉綠素銅鈉濾餅依次用適量的純水、40%乙醇及石油醚洗滌3次，放進烘箱中烘干石油醚層變?yōu)闇\綠色以除去其中的H+cl及殘留的葉黃素和其他有機雜質(zhì)。稱取0.010g葉綠素銅鈉溶于蒸餾水配成0.1%溶液，再稀釋25倍，測其pH值除去水分得墨綠色結(jié)品物略有胺味結(jié)品物0.0483g七、實驗數(shù)據(jù)與處理一、標(biāo)準(zhǔn)葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法：取標(biāo)準(zhǔn)樣品配制0.1%葉綠素銅鈉鹽溶液，用移液管分別精確量取2.5mL；2.0mL；1.5mL；1.2mL；1.0mL；0.5mL移至5個加入100mL的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na2HPO4—NaH2PO4緩沖液，搖勻定容至刻度，即0.0025%；0.002%；0.0015%；0.001%；0.0005%。以緩沖液作空白對照，分別測以上溶液在波長405nm下的吸光度值A(chǔ)405。如表1、圖1所示。表1葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定數(shù)據(jù)表（光波長405nm）0.00050.0010.00150.0.00050.0010.00150.0020.00250.003溶液百分?jǐn)?shù)（％）A4050.00050.1980.0010.3620.00150.5520.0020.7160.00250.924溶液白-分合員二、葉綠素銅鈉鹽的吸收曲線（一）標(biāo)準(zhǔn)樣品：取標(biāo)準(zhǔn)樣品配制0.001%葉綠素銅鈉鹽溶液，用分光光度計測定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波長處測定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測定一次），以緩沖液作空白對照。測定數(shù)據(jù)如表2所示，吸收曲線如圖2所示。表2標(biāo)準(zhǔn)樣品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線的測定數(shù)據(jù)表波長/nm350355360365370375380385390吸光度0.1420.1500.1570.1660.1770.1970.2170.2590.292波長/nm395400405410415420425430435吸光度0.3270.3570.3790.3770.3380.2720.2130.1690.139波長/nm440445450455460465470475480吸光度0.1190.1040.0920.0830.0740.0670.0600.0550.050波長/nm485490495500505510515520525吸光度0.0470.0440.0420.0410.0400.0390.0380.0370.037波長/nm530535540545550555560565570吸光度0.0380.0390.0390.0390.0390.0370.0360.0400.043波長/nm575580585590595600605610615吸光度0.0400.0420.0430.0430.0430.0410.0430.0460.052波長/nm620625630635640645650655660吸光度0.0590.0670.0710.0690.0640.0570.0490.0440.039波長/nm665670675680685690695700吸光度0.0350.0320.0290.0260.0240.0210.0190.017圖2標(biāo)準(zhǔn)川綠索銅鈉吸收曲線

（二）產(chǎn)品：取產(chǎn)品配制0.004%葉綠素銅鈉鹽溶液，用分光光度計測定，用1cm的比色杯，在400nm-700nm波長處測定溶液吸光值A(chǔ)（每隔5nm或10nm測定一次），以緩沖液作空白對照。測定數(shù)據(jù)如表3所示，吸收曲線如圖3所示。數(shù)據(jù)記錄：1、產(chǎn)品的質(zhì)量是0.0483g（借第12組：馮奕淇和雷春雨的實驗結(jié)果）2、產(chǎn)品產(chǎn)率:W=0.0483/50*100%=0.0966%3、吸光比二A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8表3產(chǎn)品葉綠素銅鈉鹽吸收曲線的測定數(shù)據(jù)表波長/nm350360370380390400410420430吸光度0.0680.0640.0600.0580.0610.0620.0650.0640.057波長/nm440450460470480490500510520吸光度0.0510.0470.0430.0390.0380.0360.0350.0330.034波長/nm530540550560570580590600610吸光度0.0340.0340.0330.0330.0320.0330.0350.0350.035波長/nm620630640650660670680690700吸光度0.0350.0370.0370.0350.0360.0350.0380.0370.035圖3葉綠素曲線有完全烘干，實際用于配制溶液的產(chǎn)品的質(zhì)量小于稱量的質(zhì)量。配制溶液的原因：由于產(chǎn)品純度較低，所以相應(yīng)的用于配制溶液的產(chǎn)品的質(zhì)量也應(yīng)該增多，而配的溶液的含量較小，這可能就造成了所測得的吸光度較小的原因。實驗失敗的原因：1、蠶沙不過粉碎，可能導(dǎo)致葉綠素溶解不過充分，加乙醇回流時，時間2小時每次，因浸提不充分，浸提時間不夠會導(dǎo)致提取率過低。2、皂化1小時后，用石油醚萃取，上層雜質(zhì)還是綠色，可能是皂化時間不夠，這步導(dǎo)致了大量葉綠素的流失，以致最終產(chǎn)率只有微量而無法配置葉綠素溶液測吸光度。3、整個實驗過程中洗滌與過濾次數(shù)較多，而葉綠素鹽粘稠易粘附在濾紙上，很不容易取下，且在洗滌過程也有葉綠素鹽的損失。以上兩項操作直接影響到產(chǎn)率的高低。4、調(diào)酸銅代這步時，由于保溫后趁熱過濾時過濾速度比較慢，還沒過濾完就用95%的乙醇邊洗滌變過濾，乙醇作用是析出葉綠