4節(jié)-噬菌體抗體工程

4節(jié)--噬菌體抗體工程第一頁(yè)，共20頁(yè)。

利用靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒ǎㄓH和→洗脫→擴(kuò)增→親和的循環(huán)步驟），洗去非特異結(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫(kù)中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過(guò)噬菌體DNA序列測(cè)序出來(lái)，使得表達(dá)蛋白（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）之間完美地結(jié)合起來(lái)，為生物科學(xué)提供高效而實(shí)用的研究手段。一噬菌體展示的基本原理第二頁(yè)，共20頁(yè)。

SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedantigensonthevirionsurface.Science,1985,228:1315-1317.

1985年Smith首次通過(guò)基因工程的手段,將外源基因插入絲狀噬菌體基因組中,從而使表達(dá)的外源肽或蛋白與噬菌體外殼蛋白一起展示在噬菌體表面,由此建立了噬菌體展示技術(shù)。

1990年Scott等首次將隨機(jī)序列肽與絲狀噬菌體表面蛋白g融合展示在噬菌體表面,建立了噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)。

ScottJK,SmithGP.Searchingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386.噬菌體展示技術(shù)的突破第三頁(yè)，共20頁(yè)。

噬菌體可以是單股DNA(如M13、fd和f1)、雙股DNA(如λ噬菌體)、雙股RNA(如f6)或單股RNA(如MS2和QB)。噬菌體在自然環(huán)境中普遍存在,數(shù)量和種類遠(yuǎn)多于細(xì)菌。

噬菌體是細(xì)菌病毒,在與宿主細(xì)胞特異性受體結(jié)合并注入其DNA后,能將其DNA整合進(jìn)宿主基因組(溶原性),或用于合成新的噬菌體顆粒。在真核宿主中,噬菌體不能復(fù)制,如無(wú)合適的原核宿主,噬菌體如同無(wú)生命的顆粒性抗原。噬菌體展示技術(shù)及其應(yīng)用第四頁(yè)，共20頁(yè)。噬菌體展示技術(shù)（PhageDisplaytechniques，PDT）起源于1985年,是一種用于篩選和改造功能性多肽、蛋白質(zhì)強(qiáng)有力的生物技術(shù)，廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)、基因克隆等多個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域。

目前噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展非常迅速，在抗原決定簇的定位、蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的確定、特異調(diào)節(jié)分子的分離和人工抗體和疫苗的制備、診斷技術(shù)、酶抑制劑的研究開(kāi)發(fā)、多肽藥物的研制等生物技術(shù)研究的不同領(lǐng)域得到了應(yīng)用，并對(duì)這些領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響

在臨床上接受過(guò)噬菌體治療的病人對(duì)細(xì)菌和病毒感染的抵抗力增強(qiáng),噬菌體能上調(diào)感染病人的免疫應(yīng)答。噬菌體治療能改變血清α腫瘤壞死因子(TNF-α)水平,體外加入噬菌體能提高血細(xì)胞培養(yǎng)物中的TNF-α和白細(xì)胞介素6水平。IL-6涉及Th2型應(yīng)答,對(duì)誘導(dǎo)B細(xì)胞分化成抗體形成細(xì)胞特別重要?？傊?這些結(jié)果表明噬菌體能作為細(xì)胞和體液免疫的天然佐劑。噬菌體展示技術(shù)的概論第五頁(yè)，共20頁(yè)。目前，能用于蛋白質(zhì)/多肽展示的噬菌體系統(tǒng)有絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)和T7噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體表達(dá)系統(tǒng)第六頁(yè)，共20頁(yè)。T7噬菌體基因組由39936bp雙鏈線性DNA組成，有160bp的突出末端。T7噬菌體衣殼蛋白通常有2種形式，10A（344氨基酸）和10B（397氨基酸），10B是在10A的341個(gè)氨基酸的翻譯框中產(chǎn)生的(translationalframeshift)，約占衣殼蛋白的10%，功能性衣殼或者由10A、或者由10B、或者由10A和10B以一定比例構(gòu)成，這說(shuō)明T7衣殼蛋白能夠容納變異體。獨(dú)特的10B衣殼蛋白區(qū)存在于噬菌體表面，所以被用作噬菌體展示。不像絲狀噬菌體系統(tǒng)，展示在T7表面的多肽或蛋白質(zhì)不需要通過(guò)細(xì)胞膜分泌出來(lái)，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍廣。T7展示系統(tǒng)可以高、中、低拷貝地展示不同分子量的蛋白質(zhì)，是目前最為理想的展示系統(tǒng)。VectorCloningRegionsOfT7Select10-3b第七頁(yè)，共20頁(yè)。

與傳統(tǒng)的質(zhì)粒DNA疫苗相比,利用噬菌體展示技術(shù)研制基因工程疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：噬菌體傳遞的DNA疫苗誘生的抗體應(yīng)答持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng),滴度更高；噬菌體有強(qiáng)的免疫原性，是天然的免疫佐劑；噬菌體疫苗在對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢(shì)明顯，而且噬菌體疫苗能直接靶向抗原提呈細(xì)胞，使用比質(zhì)粒DNA疫苗低得多的劑量就能誘發(fā)很好的免疫效果。還體現(xiàn)于甚至在病原體不夠確定、極度危險(xiǎn)或不易獲得的情況下,如研制SARS(又稱“非典型肺炎”)疫苗,同樣可通過(guò)獲得特異性抗病原體抗體進(jìn)行肽庫(kù)篩選,設(shè)計(jì)有效、特異、安全的模擬肽疫苗,具有抗烈性傳染病疫苗設(shè)計(jì)的巨大優(yōu)勢(shì)。噬菌體展示技術(shù)研制基因工程疫苗的優(yōu)劣

噬菌體展示疫苗十分有希望,但其技術(shù)存在一定的內(nèi)在的限制性,例如,在傳遞噬菌體衣殼蛋白-疫苗肽融合體時(shí),不是所有的構(gòu)象活性表位都能被保留下來(lái)？此外，噬菌體生長(zhǎng)于原核細(xì)胞，因此噬菌體疫苗將缺少真核細(xì)胞翻譯后的糖基化信號(hào)。第八頁(yè)，共20頁(yè)。二噬菌體抗體庫(kù)的種類根據(jù)抗體基因來(lái)源組成的不同,抗體文庫(kù)大致可分為4種:

①天然抗體文庫(kù)(nativeantibodylibrary),抗體基因片段來(lái)自未經(jīng)免疫的供體,該文庫(kù)代表了供體內(nèi)天然的抗體譜;

②免疫后抗體文庫(kù)(ImmunizedantibodyLibrary),抗體基因片段克隆自經(jīng)抗原免疫過(guò)的供體,該文庫(kù)一般具有較強(qiáng)的抗原特異性和親和力;

③半合成抗體文庫(kù)(Semi-syntheticantibodyLibrary),該文庫(kù)抗體重鏈可變區(qū)基因片段中CDR1和CDR2來(lái)自人胚系VH片段,而CDR3則是人工合成的編碼5～15個(gè)氨基酸的隨機(jī)序列,該文庫(kù)容量極大,可達(dá)1012,但抗體的親和力較低,同時(shí)人工合成的CDR3可能增加抗體的免疫原性;

④合成抗體庫(kù),是在對(duì)人或鼠抗體的序列和主體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,合成多條VH和VL基因,用來(lái)替代所有的抗體類別和結(jié)構(gòu),組成多個(gè)總抗體庫(kù),其CDR區(qū)可通過(guò)限制酶方便地更換,該庫(kù)便于進(jìn)行分子模擬和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),不足之處是操作復(fù)雜,且所獲得抗體的免疫源性往往較高。

第九頁(yè)，共20頁(yè)。噬菌體抗體庫(kù)綜合運(yùn)用了3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

①RT-PCR技術(shù),使人們可以用一組引物克隆出全套免疫球蛋白可變區(qū)基因;

②成功地采用大腸桿菌分泌表達(dá)具有生物活性的抗體功能片段;

③噬菌體表面展示技術(shù)的建立,目前建庫(kù)采用較多的噬菌體載體是pComb3及pCANTABLE,其主要技術(shù)流程是,先從脾或外周淋巴細(xì)胞等提取RNA,采用與抗體可變區(qū)基因兩側(cè)保守區(qū)互補(bǔ)的引物,通過(guò)RT-PCR分離擴(kuò)增抗體的輕、重鏈基因片段,再經(jīng)過(guò)隨機(jī)重排組合,將基因片段克隆λ噬菌體載體中,組成噬菌體抗體文庫(kù),庫(kù)中每一個(gè)噬菌體在其表面可表達(dá)一種特異性抗體(Fab或ScFv)。第十頁(yè)，共20頁(yè)。噬菌體抗體庫(kù)表達(dá)載體λ噬菌體------菌斑印跡篩選克隆,外源性片斷不能大,庫(kù)容量小單鏈絲狀噬菌體---是載體中包含單價(jià)及多價(jià)兩個(gè)子系統(tǒng),可篩選出高親和力抗體.噬菌粒---應(yīng)用最多表達(dá)載體,能高效模擬B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的原核表達(dá)系統(tǒng).第十一頁(yè)，共20頁(yè)。噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建方法

免疫球蛋白基因可來(lái)源于雜交瘤細(xì)胞、體外免疫的細(xì)胞、致敏及非致敏的B淋巴細(xì)胞（骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴結(jié)、扁挑體或經(jīng)過(guò)免疫的小鼠脾臟等），其中以淋巴結(jié)的B淋巴細(xì)胞較好。

建庫(kù)的過(guò)程是：先提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增可變區(qū)基因，運(yùn)用兩種不同的限制性內(nèi)切酶分別對(duì)純化的輕鏈PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體進(jìn)行酶切，再對(duì)切割產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，按一定比例將載體和輕鏈連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒即為輕鏈庫(kù)。再對(duì)重鏈PCR產(chǎn)物和輕鏈庫(kù)進(jìn)行雙酶切，純化后按一定比例連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加入輔助噬菌體培養(yǎng)，離心取上清液，加入PEG沉淀并收集噬菌體顆粒即得到噬菌體總抗體庫(kù)。一mRNA的來(lái)源1,雜交瘤細(xì)胞2,免疫淋巴細(xì)胞或骨髓中的漿細(xì)胞3,未經(jīng)免疫的B淋巴細(xì)胞二抗體基因的擴(kuò)增三抗體基因的克隆四篩選1,表位篩選2,功能性篩選3,選擇性感染篩選第十二頁(yè)，共20頁(yè)。噬菌體抗體庫(kù)優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用前景優(yōu)點(diǎn)1噬菌體抗體技術(shù)可建相當(dāng)量庫(kù)容的抗體庫(kù).2噬菌體抗體技術(shù)無(wú)需免疫動(dòng)物.3適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn).4噬菌體抗體庫(kù)能夠模擬天然抗體庫(kù).5抗體表型和基因型一致.6篩選噬菌體抗體庫(kù)第十三頁(yè)，共20頁(yè)。

在免疫系統(tǒng)中,抗體親和力成熟過(guò)程是多樣性B細(xì)胞群在抗原“壓力”選擇下發(fā)生分化,抗體可變區(qū)基因發(fā)生大量突變,抗原特異性B細(xì)胞克隆進(jìn)一步增殖分化,而非特異性克隆則發(fā)生凋亡或處于增殖劣勢(shì),最終產(chǎn)生高親和力抗體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)可以通過(guò)多條途徑,模擬上述免疫系統(tǒng)抗體親和力成熟過(guò)程。

其一,提高抗體庫(kù)的質(zhì)量,可選用經(jīng)免疫應(yīng)答反應(yīng)后的抗體基因構(gòu)建高特異性抗體庫(kù),或構(gòu)建高庫(kù)容量抗體庫(kù)。

其二,突變技術(shù)的運(yùn)用,可有目的地進(jìn)行氨基酸替換(定點(diǎn)突變)、PCR錯(cuò)配以及大腸桿菌突變株對(duì)抗體可變區(qū)基因進(jìn)行大量隨機(jī)突變,再?gòu)闹泻Y選高親和力抗體.

其三,鏈替換,即通過(guò)抗體庫(kù)內(nèi)的重、輕鏈基因重新配對(duì),增加抗體庫(kù)的多樣性,這樣可大大提高篩選出高親和力抗體的機(jī)會(huì)。盡管提高抗體親和力的新技術(shù)不斷出現(xiàn),然而如何有效獲得高親和力抗體仍是抗體庫(kù)研究的核心課題之一,也是基因工程抗體能否應(yīng)用的關(guān)鍵.第十四頁(yè)，共20頁(yè)。第五節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)抗體人源抗體（humanantibody）轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)系統(tǒng)正是針對(duì)目前鼠源抗體臨床應(yīng)用存在的嚴(yán)重問(wèn)題而提出的，其目的是通過(guò)人工染色體操作、染色體同源重組、較大片段DNA原核注射等關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)的建立，再結(jié)合基因剔除技術(shù)，最終建成僅產(chǎn)生人Ig而無(wú)鼠內(nèi)源相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠品系。第十五頁(yè)，共20頁(yè)。一分泌完全人源抗體基因鼠的建立人淋巴細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞融合分泌人型Ig1人鼠型雜交瘤細(xì)胞最終丟失人的染色體2人型雜交瘤細(xì)胞人致敏淋巴細(xì)胞人骨髓瘤細(xì)胞融合分泌人型Ig技術(shù)困難3噬菌體展示技術(shù)

原始人Ig基因庫(kù)中產(chǎn)生的抗體片斷沒(méi)有經(jīng)過(guò)天然的抗體的成熟過(guò)程,故親和力低,而且需要復(fù)雜的抗體基因工程技術(shù)和多輪篩選才能獲得.另外,該技術(shù)生產(chǎn)的抗體片斷還需與抗體的缺失部分連接以產(chǎn)生一個(gè)完整的抗體.41994年美國(guó)CellGenesys公司和Genpharm公司通過(guò)人的免疫球膽白基因替代鼠的同類基因使鼠能在接受人抗原免疫后分泌人抗體,轉(zhuǎn)基因小鼠作為安全的人抗體載體獲成功.人抗體基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi),分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠.其前提是人的抗體基因片斷在小鼠體內(nèi)進(jìn)行重排并表達(dá),并且這些片斷能與小鼠細(xì)胞的信號(hào)機(jī)制相互作用,即抗原刺激后,這些片斷可被選擇,表達(dá)并活化B細(xì)胞分泌人抗體.利用基因打靶技術(shù),將編碼人抗體輕重鏈的基因片斷全部轉(zhuǎn)到自身抗體基因位點(diǎn)已被滅活的小鼠基因組中,再經(jīng)過(guò)繁育篩選,建立了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠品系.第十六頁(yè)，共20頁(yè)。

人源化抗體技術(shù)熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）1微基因重組子技術(shù)把人Ig基因組中間斷存在的基因片斷連在一起,分別組建成輕,重鏈微基因,隨后將這些構(gòu)建的微基因質(zhì)粒注入小鼠胚胎原核中,從而獲得了含有人重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)基因鼠.2微胞干細(xì)胞雜交技術(shù)(ESmicrocellhybride)3酵母人工染色體(YACyeastartificialchromosome).第十七頁(yè)，共20頁(yè)。二小鼠生產(chǎn)完全人源抗體的機(jī)制雜交瘤技術(shù)

人源化抗體

將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基