卵黃抗體生產(chǎn)及應用技術

卵黃抗體生產(chǎn)及應用技術第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)容一、生產(chǎn)技術二、應用技術三、問題及展望第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一

一、生產(chǎn)技術

(一)IgY產(chǎn)生過程(二)IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因素(三）IgY結(jié)構(gòu)特點(四)IgY相對與IgG的優(yōu)勢(五)IgY純化、活性測定及保存第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(一)IgY產(chǎn)生過程1.腔上囊是禽類特有的控制體液免疫的淋巴器官；

2.腔上囊中B細胞受到抗原刺激后分化成漿細胞，后者分泌抗體進入血液；

3.通過血液循環(huán)和輸卵管上皮層分泌濾泡，產(chǎn)蛋雞將母源抗體選擇性分泌到卵黃內(nèi)；

4.卵黃中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA轉(zhuǎn)移到蛋清中）；

5.小雞通過IgY實現(xiàn)獲得性被動免疫(豬、牛、馬屬通過初乳；兔通過胎盤)；

6.卵黃中含有多種不同抗體（約200種，滴度取決于暴露程度；M.Coleman,2000)；

7.用某種病原菌免疫母雞，可產(chǎn)生特異性IgY，Sugita等（1996）用26種甲醛滅活病原菌免疫產(chǎn)蛋雞，IgY可預防多種疾病。第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一(二)IgY轉(zhuǎn)移時間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因

素1.用HI、ELISA、ID檢查卵黃中IgY，抗體應答形成時間晚于血清1～2周（TheresaHP,1985；鴨腺病毒），以后與血清測得的HI滴度一致，也有報道卵黃卵黃抗體具有累積作用；

2.經(jīng)加強免疫，卵黃中特異性IgY效價能維持數(shù)月奶至1年；

3.一個卵黃約含100～400mgIgY，一只產(chǎn)蛋雞每年可獲得40～50gIgY（D.Carlander,2002），相當與30只家兔同期內(nèi)血清IgG產(chǎn)量；

4.卵黃中抗原特異性抗體數(shù)量占IgY平均10%，范圍是5%（抗胰島素抗體）～28%（抗鼠IgG抗體），取決于免疫個體、免疫程序及抗原的免疫原性；第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（2）5.影響IgY產(chǎn)量的因素包括：（1）抗原的質(zhì)與量（顆粒/可溶性抗原、類毒素/菌體抗原、活菌/死菌，免疫麻痹；高免疫原性和安全）（2）機體方面，A包括產(chǎn)蛋雞品種（來航雞、洛島紅雞及其雜交后代的特異性IgY最高平均濃度有顯著差異（DCarlander,2002)、B產(chǎn)蛋率和產(chǎn)蛋間歇與IgY濃度、C蛋重及卵黃重、D營養(yǎng)影響免疫系統(tǒng)發(fā)育、免疫機能狀況和生產(chǎn)性能、E健康狀況（SPF雞群，起碼應無免疫抑制性疾病和垂直傳播性疾病，對父母代IBD的免疫）（3）免疫途徑、免疫程序、佐劑第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（3）6.生產(chǎn)卵黃抗體典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）：

(1)首免，胸肌注射0.5～1mg/羽弗氏完全佐劑等體積乳化抗原；

(2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐劑乳化抗原進行2～4次加強免疫，劑量逐步放大1～2倍。這種多次注射加強劑量的抗原使之產(chǎn)生較高自動獲得性免疫的過程，稱之為“超免疫作用”。第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（三）IgY結(jié)構(gòu)特點1.分子量160～180kDa，稍大于IgG（160kDa）；

2.多一穩(wěn)定區(qū)而少一鉸鏈區(qū)（鉸鏈區(qū)有較多脯氨酸，具有韌性，與抗體分子構(gòu)型變化有關）；第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（1）

這種差異沒有影響IgY的抗原-抗體結(jié)合特性和結(jié)合能力，結(jié)合價也是2（Warr等,1995），然而對于pH、溫度及蛋白水解等引起構(gòu)象變化的環(huán)境條件，IgY比IgG穩(wěn)定；由于缺乏鉸鏈區(qū)，兩個抗原結(jié)合片段（Fab）緊密排列，使IgY缺少韌性及功能種類，在確定條件下沉淀及聚合反應能力降低（Warr等，1995），這使其具有抵抗幼齡動物胃酸屏障的能力。

3.IgY能介導過敏反應，與哺乳動物的IgE相似。第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（四）IgY相對IgG的優(yōu)勢1.高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)對禽有較強的免疫原性，且產(chǎn)生有效免疫反應所需抗原量小（Danielpour.D,1993），如IGF-1，且免疫應答快；2.免疫反應具有交叉性，血緣越近，交叉反應程度越高；由于結(jié)構(gòu)上差異，IgY與IgG幾乎沒有交叉免疫反應，減少了非特異結(jié)合和假陽性；減少非特異性結(jié)合使免疫學檢測靈敏性提高（達50%）；3.IgY具有較強的抗熱、抗酸、抗離子強度和一定的抗酶分解能力（相對于IgG），提純后IgY在合適條件儲存10年滴度沒有損失（Olovson等，1993），幼畜可以口服，經(jīng)保護處理后成年動物也可以口服，提純后可以肌注（孫希琪，1995）；4.USDA和FDA認為卵黃抗體是GRAS（generallyregardedassafe）且已允許商業(yè)生產(chǎn)用于人；第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（1）5.符合動物福利原則。因此，IgY具有可規(guī)模生產(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高、安全性好等優(yōu)點,比實驗室條件下通過實驗動物制備有限的高免血清更有實用性。

第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（五）IgY純化、活性測定及保存

1.雞蛋儲存在+4℃條件下6個月IgY活性損失很小。用做食品和飼料添加劑，或獸醫(yī)臨床上，IgY多以全卵黃或其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。2.用于診斷分析或純化生物活性分子，或在人醫(yī)臨床上則需要提高IgY純度或提純特異性IgY。

IgY純化分三步：

第一步是粗提，將含有IgY的水溶性蛋白與水不溶的脂類和脂蛋白分離，即除去脂質(zhì)；方法有超濾、有機溶劑萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，經(jīng)粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白質(zhì)的15%；第二步用硫酸葡聚糖鈉等進一步沉淀，提純出純度大于80%的IgY，此時的IgY要低溫或凍干保存；第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（1）

第三步是精提法：使用凝膠滲透層析、陰離子交換層析或超濾方法進一步純化，獲得純度96%～99%的IgY。

3.Akita等建立的水稀釋法：先在微酸條件下用水稀釋卵黃，分離出卵黃蛋白；再用鹽析、超濾、乙醇沉淀、凝膠過濾等進一步純化IgY。4.特異性抗體采用親合色譜法純化，離子交換層析法濃縮；或用免疫親合法直接從水溶液中提取。5.普洛瑪格公司的卵黃抗體純化系統(tǒng)（Promega'sEGGstractIgY）提供了快速和簡易的IgY分離方法。該系統(tǒng)能在約1小時內(nèi)提取2～5mg/ml純度75%的IgY。第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（2）6.提純方法的選擇取決于IgY產(chǎn)量、純度、費用要求和技術水平。7.常用ELISA測定IgY活性。8.提純后抗體冷凍或凍干保存。50%（w/v）蔗糖能在熱、酸和高壓等加工條件下阻止IgY變性，在不能冷藏或在加工過程中保護IgY活性。9.對提純的IgY進行微膠囊化處理能顯著增強起抗胃蛋白酶和胃酸的能力。第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一二、IgY應用技術IgY上述優(yōu)勢及其對病原菌感染的防御無動物種屬差異使其在傳染病的預防、診斷及治療、免疫抗體監(jiān)測、免疫分析、酶聯(lián)分析以及做為功能食品因子和抗生素替代品都很有用，特別是用雞高免卵黃抗體防治其他動物和人的腸道疾病。第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一內(nèi)容（一）在家禽中的應用（二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用（三）對仔豬和犢牛腹瀉的防治（四）在奶牛上的應用（五）在人醫(yī)上的應用第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（一）在家禽中的應用1.目前國內(nèi)應用卵黃抗體防治的禽病有傳染性法氏囊、雞新城疫、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、番鴨細小病毒、雞減蛋綜合征等。2.用IgY治療IBD和ND混合感染。3.抗沙門氏菌LPS特異IgY阻止禽蛋和禽肉中沙門氏菌粘附、控制其增殖上發(fā)揮明顯作用（H.H.Sunwoo等，2000）。4.IgY對雛雞傳染病的預防有獨到優(yōu)點；用于緊急預防接種見效快；5.IgY代替血清抗體對禽傳染病做出診斷和疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測。第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用1.通過飼料用IgY治療鰻魚愛德華氏菌癥。第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（三）IgY對仔豬和犢牛腹瀉的防治

1.幼齡動物消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，吸收初乳的同時口服特異性IgY，保護作用將顯著增強。這方面應用最多的是對仔豬大腸桿菌及仔豬、羔羊輪狀病毒腹瀉的治療。2.大腸桿菌導致仔豬腹瀉及抗大腸桿菌菌毛IgY阻止其在小腸粘膜上附著，體外粘著抑制試驗支持這一假設（Yokoyama等,1992）。3.李國平等（2002）證明：仔豬出生后頭36小時內(nèi)口服IgY不被分解，和注射效果無差異。卵黃抗體與菌毛抗原的親和力遠遠超過母乳及高免血清中抗體與抗原的親和力，對控制此病極為有利。4.如分離自家病原制備IgY用于本豬場腹瀉防治，更有針對性，其效果優(yōu)于抗生素。第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（1）5.卵黃抗體治療仔豬黃痢的效果(肖馳，1997)

注：與其它三組相比，差異極顯著（p<0.005）

6.人工攻毒試驗證明，含特異性牛冠狀病毒（BCV）或產(chǎn)毒素大腸桿菌的卵黃和初乳具有類似防治犢牛腹瀉的效果。組別治療數(shù)治愈數(shù)治愈率卵黃抗體慶大霉素土霉素痢特靈

131685733

128534523

97.7177.9478.9569.69

第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（四）IgY在奶牛上的應用

1.乳房炎給奶業(yè)帶來巨大損失，在美國，1992年乳房炎造成十億美元損失；3.SCC是衡量乳房感染與否及感染程度的指標，主要病原是葡萄球菌和鏈球菌；4.日糧中特異性抗葡萄球菌和鏈球菌IgY顯著降低了SCC；5.IgY給量與產(chǎn)奶量和奶中無脂固型物增加相關；6.MColeman(2000推測)，IgY酶解片段（Fab）含9-11個氨基酸，可能不再降解而被吸收進入血液，仍能在循環(huán)中發(fā)揮活性作用。第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一（五）IgY在人醫(yī)上的應用

1.通過口服病原特異性抗體建立人被動免疫保護，特別是對于胃腸道抗原。雞蛋是正常的食物組成，口服IgY沒有毒副作用的風險，是人們喜歡的口服免疫治療物品。2.用抗鏈球菌卵黃抗體漱口能減少鏈球菌在牙齒琺瑯質(zhì)上的定居（HattaH等，1997），有效預防齲齒。3.雖然可以通過遺傳工程設計出HIV顆粒的許多抗原決定簇，由于HIV不斷變異，使抗HIV抗原決定簇的單克隆治療AIDS病人缺乏長期效果；IgY是多抗，能同時識別幾個位點，提高了結(jié)合HIV顆粒的機會，使免疫系統(tǒng)除去HIV。4.卵黃抗體保護免疫抑制病人或治療先天性免疫缺陷患兒。5.IgY作為分泌型IgA的替代物，為免疫抑制病人內(nèi)臟表面提供保護。第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期一續(xù)（1）6.與抗生素相比，IgY不會產(chǎn)生抗藥性，是安全、有效、廉價的方式。人醫(yī)上用IgY預防小兒病毒性腹瀉已取得理想