內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中重組表達載體的構建四川

內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中重組表達載體的構建生物科學2003級廖俊華指導教師陳惠教授摘要：以生物化學與分子生物學實驗室克隆并測序的枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因（Genbank登錄號：DQ782954）為模板，通過PCR將編碼信號肽的序列去除，然后與pMD18-TVector克隆載體連接，構建pMD18-TVector亞克隆載體。對pMD18-TVector質(zhì)粒先進行BglⅡ單酶切，回收后再進行SphⅠ單酶切，通過兩次單酶切膠回收內(nèi)切葡聚糖酶基因（不含信號肽），并構建巨大芽孢桿菌重組表達載體pHEC-End，將重組表達載體轉化到大腸桿菌DH5α中。通過對轉化子進行菌落PCR和質(zhì)粒的酶切檢測證明成功構建了內(nèi)切葡聚糖酶的巨大芽孢桿菌表達載體。關鍵詞：巨大芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，內(nèi)切葡聚糖酶，重組表達載體ConstructionofeukaryoticExpressionVectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumLIAOJun-huaBiologicalScience,Grade2003DirectedbyChenHui(Prof)Abstract:BythewayofPCR,thesequencecomingfromendoglucanasegene(GenbankNo.DQ782954)inB.subtilisC-36strainandcodingforthesignalpeptideofendoglucanasewasremoved.TheendoglucanasegenewasclonedandsequencedintheLaboratoryofBiochemistryandMolecularBiology.ThenthegenewithoutthesignalpeptidesequencewasligatedwiththecloneplasmidpMD18-T.ThepMD18-TVectorwasconstructed.First,thepasmidwascutedbyBglⅡ.Then,thepasmidwascutedbySphⅠ.Bydoubleenzyme-cut,thegeneofendoglucanaseinB.subtilisC-36strainwithoutsignalpeptidewasrecived.TheeukaryoticexpressionvectorpHEC-Endwasconstructed.Eventually,theeukaryoticexpressionvectorwastransformedintocompetentE.coliDH5α.BythewayofcolonyPCRandrestrictionenzymedigestinganalysis,theeukaryoticexpressionvectorofthegeneofendoglucanaseinBacillusMegateriumwasconstructedsuccesfully.Keywords:BacillusMegaterium，Bacillussubtilis，endoglucanase，eukaryoticexpressionvector纖維素酶是一類能夠降解纖維素，使之生成纖維二糖、葡萄糖等一系列酶的總稱，按各酶功能的不同可以分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三大類[1]。纖維素被它降解后可轉化為人類急需的能源、食物、化工原料，對于人類社會解決食物短缺和能源危機具有重大的現(xiàn)實意義[2]。隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應用，細菌纖維素酶制劑已顯示出良好的使用性能和巨大的經(jīng)濟價值[3]。纖維素酶成本高以及酶活力低已成為制約纖維素酶廣泛應用的兩大瓶頸，因此，構建高效表達的基因工程菌是降低纖維素酶成本、提高產(chǎn)量的有效手段。幾乎所有已克隆到的纖維素酶基因都在大腸桿菌中得到了表達，但是都幾乎存在著表達量低、分離提純困難的缺陷。而芽孢桿菌因具有獨特的蛋白分泌系統(tǒng)，使得在表達外源蛋白的宿主菌中深受青睞。其中枯草芽孢桿菌是應用較廣泛的一種外源蛋白表達系統(tǒng)，并且已用于商業(yè)化生產(chǎn)酶制劑，例如，Genecor廠家就以該菌作為生產(chǎn)堿性蛋白酶的工程菌[4]。近年來，巨大芽孢桿菌也在這方面顯示出了較好的應用前景，與枯草芽孢桿菌相比，巨大芽孢桿菌還具有兩大優(yōu)點：首先是它不具有堿性蛋白酶，從而使外源蛋白能很好的表達而不被降解；再次是重組質(zhì)粒能夠在宿主菌中穩(wěn)定存在[5]。有很多蛋白已經(jīng)成功地在巨大芽孢桿菌中得到過量表達，如：Rygus和Hillen[6]（1991）在巨大芽孢桿菌中成功地表達了四種外源蛋白基因，在木糖操作子的調(diào)控下，這些基因的表達提高130到350倍不等，且未發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解情況。目前還未見有關在巨大芽孢桿菌中表達內(nèi)切葡聚糖酶的報道，四川農(nóng)業(yè)大學生物化學實驗室通過自行篩選得到一株產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的枯草芽孢桿菌并克隆到了編碼該酶的基因（GenbankNo.DQ782954），擬在此基礎上構建該基因的巨大芽孢桿菌表達載體，實現(xiàn)該基因在巨大芽孢桿菌中的分泌表達。本實驗將不含信號肽枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因與巨大芽孢桿菌表達載體pHIS1525進行連接，構建重組表達載體，使之能在表達載體自身信號肽的引導下進行融合表達，為進一步研究枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中的高效表達及基因工程菌投入生產(chǎn)奠定基礎。1材料與方法1.1菌株及載體：本工作所使用的菌株和質(zhì)粒見表1。賀表1實驗險所用的菌株慮及質(zhì)粒鄰Tab糕垮1解敘Thes扮train仔and叮plasm北idus狂edin組the個exper樓iment插strai寄n/pla災smid萍Chara雞cteri環(huán)stics俘sourc沫e竟JM109卷recA1熟supE打44en輪dA1h西sdR17包gyrA滲96re座lA1t路hi預△戴(lac-斬proAB扔)F'昆Store逝din創(chuàng)this柱lab廁DH5α紙supE4脫4謠△產(chǎn)lacU1說69(φ8秀0lacZ蠅△避M15)袍recA1班Store澆din捕this乓lab竿pMD1景8-TV帝ector吃Ampr慢lacZ兔TaKaR恢aBio己techn砍ology襯pHIS1演525辮Tetr工Ampr爆xylR葉PxylA良MoBiT腥ec著B3pl眠asmid嗎pMD18港-TVe賠ctor蜓inclu稀ding策thee亭ndogl旋ucana軟sege橡ne森Const曬ructe洪din夏this拉lab曾1.2握分子生物學改試劑吳：碎引物由上海陸英俊生物技言術蹄合成；束Bgl=2\*ROMAN弟II職、引Sph=1\*ROMAN科I西、重組Ta哲qDNA綁Poly午meras典e、dNT嚇P、T4鴨DNAL用igase事、展pMD18侮-TVe荷ctor購緊自TaKa隱RaBi取otech綢nolog葡y；質(zhì)粒提腫取試劑盒、此凝膠回收試攤劑盒、籌DNAM板arker轟=3\*ROMAN葵III炒、DNA齒Marke確r=7\*ROMAN鋪VII閃、λDNA見/Hind曲=3\*ROMAN拖III銷購自天為時書代；肅氨芐青霉素無購自上海生同工。遼1.3蘭主要藥品梅NaCl、映胰蛋白胨、舒酵母浸出粉報、瓊脂粉、砍瓊脂糖、容0.1mo萍l/L乳CaCl六2朋、件甘油肺（貪終濃度為3閱0%斥）。蹦1部.4級主要儀器巾：虹電熱恒溫培餡養(yǎng)箱、HZ藥Q-F全溫方振蕩培養(yǎng)箱確、酸堿pH竊計、TGL市-16G臺茫式普通離心跑機、板式電狐泳槽、電熱約恒溫水浴鍋援、PCR儀抖、凝膠成像圖儀等。錘1.5多戴培養(yǎng)基燕、鞠抗生素走貯存液崖及梯瓊脂糖電泳恥緩沖液朋：數(shù)LB培養(yǎng)基紹：婆1%胰蛋白毫胨，1%弄NaCl，疲0.5%酵較母浸出粉，勉pH7.0沙（用1mo啄l/L的N樣aOH調(diào)P鐮H值）項；配制固體拐培養(yǎng)基時需愈加入1.5章%歇-家2.0%的丙瓊脂粉；配糊制抗生素培恨養(yǎng)基時需加稍入氨芐青霉碎素（終濃度湖為100μ車g/mL）點。循氨芐青霉素寸（Amp）快貯存液核[摩7詠]盜：100μ腰g/mL（分溶于雙蒸水命中），過濾井除菌，小份悟分裝（1m糟L/份）后社，-20℃蠢保存。敞瓊脂糖電泳濾緩沖液嶼[8]厘：佩①朱5×TBE錫貯存液：5刊4gTr啞is堿，2烤7.5g硼輕酸，20m嫌L0.5板mol/L徑EDTA呢（pH8.挨0），溶于剪1L去離子癥水，用時稀歉釋10倍。?、诳?.5mo潑l/LE涌DTA（p握H8.0）劍：將186壤.1g二水扣乙二胺四乙候酸（EDT狼A-Na.匙2H艱2裕O）加入8果00mL水填中，用磁力工攪拌器劇烈電攪拌，用N展aOH調(diào)節(jié)覺pH至8.慕0，定容至織1L。叼③診0.7%的你瓊脂糖凝膠時：稱取0.莫7g瓊脂糖冒于100教mL0.畝5×TBE翁中，用微波做爐加熱置溶私液澄清為止估，然后加入修5μL的G斷oldV塘iew核酸最染料，混勻澡即可用。童1.6流肢方法寸.偉千另引物的設計娃：晃根據(jù)已經(jīng)克造隆并測序的輕內(nèi)切葡聚糖走酶基因柿（退Genba杠nk登錄蠻號：DQ7產(chǎn)82954舞）去，結合信號興肽預測結果含，應用Pr亭imer勢premi今er5.0應軟件設計一漫對引物，使鈔其通過PC創(chuàng)R去掉該基交因自身信號戶肽編碼序列請，冬同時加入適燙當?shù)拿盖形淮c（剖Bgl=2\*ROMAN息II玉、宴Sph=1\*ROMAN滴I烤）塊，賢使其能夠通適過連接將該興基因置于表毯達載體信號辛肽編碼序列倡之后睡（倘表達載體隨pHIS1艦525的多僅克隆位點序候列遵如圖1）率，栽且保證正確蘆的閱讀框棋。佩已經(jīng)預測的按枯草芽孢桿哀菌C-36健內(nèi)切葡聚糖售酶蛋白序列瓜信號肽切割跑位點在29凍位和30位便氨基酸殘基且之間，成熟肅蛋白為47騙0桃氨基酸多肽鏈，因此潛設計職引物如下：爬上游引物（親P1）：5紛’熔AGATC籮T賊C償A梨GCAGA胖GACAA雷AAACG廢CCAGT知3’內(nèi)下游引物（兄P2）：5器’樓GCATG綠C士CTAAT域TTGGT貧TCTGT揮TCCCC恥AA栽3’筐下劃線是引藥入的酶切位六點，分別是狼Bgl趙Ⅱ賣、斥Sph備Ⅰ豆；A是為了品不改變閱讀亡框而引入的恭堿基。坡圖1珠pHIS1參525的多傾克隆位點序裁列淡Fig1匙找Sequ董ence偽ofth椅emul串t秤iple祖cloni誤ngsi跟tes(M苗CS)of唇pHIS袋1525竿沉巖目的基因的忘獲得般：雷顧.1濕批B3質(zhì)粒的咬提取及其P極CR律接種一環(huán)B謠3菌株于1英0mLL瘦B液體培養(yǎng)其基中，37泥℃200r炮/min培羨養(yǎng)過夜，用努質(zhì)粒提取試貌劑盒按嚴操作艷說明提取B貌3質(zhì)粒鉛[瞧9雷]輕。以提取的互B3質(zhì)粒為伍模板根據(jù)設寄計合成的引貪物進行PC蟲R幫[幫10吼]塔，通過PC娘R獲得目的搭基因，其反召應體系如拌表2微：族表2PC彈R反應體系劑Table必響2促Compo投sitio涌nof川PCR客合試劑名稱辟庭用量元鋪ddH畫2尼O須32.5反μ飲L溉10攜×亦PCRb除uffer壯普5.0怠μ女L捷25mmo序l/LM椒gCl赤2莫家2.0轟μ樸L闖P1轉1.0擊μ周L罵舅拒P2擦1.0御μ柳L翁dNTP挽mixtu斯re研6.0冠μ敵L純模板DNA眨般2.0困μ高L雞Taq紋聚合酶籃瓦素0.5習μ輛L績能T魚otal聲volum催e寶50.0乒μ巷L爹按上述順序資加入各組分原后混合均勻頭，PCR反攏應參數(shù)為：毒94佛℃預變性2兩min，悶94℃變性馬1min，黎65℃退火疲1min，匹72℃延伸謹90s，3罷0個循環(huán)后便，72℃再敗延伸10m歷in，4℃私保存。反應紅結束后取3炮μLPCR盯產(chǎn)物晌進行0.7希%瓊脂糖凝惹膠電泳檢測迷。和郵.2側帆PCR產(chǎn)物弓的純化桶由于克隆需刮要的DNA距片段需要較攝高的純度，濾PCR產(chǎn)物頃需經(jīng)過瓊脂毅糖凝膠電泳群充分分離后左，利用普通壽瓊脂糖凝膠三DNA回收速試劑盒從凝懸膠中回收目賓的DNA片茶段手[洪11信]待。靠裙噸目的基因的走克隆好:檢環(huán).1即大腸桿菌J湯M109（覆或DH5α版）感受態(tài)細頭胞覆的制備顫：葵參照《分子鍵克隆試驗指為南》（第三餃版），采用稱氯化鈣法制靠備大腸桿菌娛感受態(tài)細胞弱，具體方法遠如下：敬挑取一環(huán)闊E.col捎i燙JM109兵（或DH5竹α）菌株在分LB平板上絹劃線37℃朝培養(yǎng)后，勁挑斯取單菌落轉斷到10mL園LB液體列培養(yǎng)基中，澤37℃20購0r/mi引n培養(yǎng)過夜兩；蟻將上述培養(yǎng)噴液按2%接昆種量接種到薄50mL擴LB液體培宅養(yǎng)基中37網(wǎng)℃200r罰/min振餐蕩培養(yǎng)2淘-瞧3小時；條將培養(yǎng)后的麥菌液置冰浴慨中10mi搶n后轉移到參無菌的50濟mL離心管喇中，4℃4顧000r/棕min離心久10min庭，去掉上清簡液，將管倒郊置1min妄使痕量培養(yǎng)籠液流盡；色向管中加入福20mL無惕菌的預冷的假0.1mo栽l/LCa紡Cl泊2仿溶液重新懸喘浮菌體，4拼℃4000痕r/min割離心10痕min，去紀掉上清液；任向管中加入應2mL無菌黨的預冷的0礎.1mol社/LCaC撒l躲2血溶液重新懸溝浮菌體；輪剛做的感受倦態(tài)細胞可直厭接用于轉化昏試驗，也可戴將剩余的感嗓受態(tài)細胞加況入終濃度為頁30%的甘前油分裝于盈1.5mL助離心管（互100籃μL/管）鑒置-70男℃保存準。摟險.2桑連接與轉化宣佳.2.1胞連接：視（連接體系罩[但12喇]攏如叫表3）骨表3買目的基因與捐p舞MD娛18-T笑Vecto穿r克隆載體角的連接體系索Table仆禍3Th血elig協(xié)ation魯syst逝erm扶倒試劑名稱梳夢喪用量偷攝膠回收PC中R產(chǎn)物媽5燃μ時L鋒pMD18拍-TVe屑ct潛or冬1秒μ版L岡隨Liga業(yè)tion馳Mix武粉4磚μ州L票濫T念otal頸volum遮e樸10胡μ慶L別煌將該反應管許置PCR儀支16℃保溫眨3h。裙那.2.2猴轉化：氣（轉化方法倘[柴13坐]切如下所述）巴取裝有10纖0容μL礎E告.已coli睡JM109閣感受態(tài)細胞壘的1.5m翼L離心管一繁支，置冰浴割中解凍；系將苦上述鈴連接好的連錄接液全部加攝入到上述離摟心管中，并匠用加樣器輕膜輕混合均勻傅；花將離心管放塌置冰浴中靜逼置30mi違n；緩30mi熱n后將離心賺管放置能42℃條恒溫水浴中述靜置2mi犧n；修迅速將離心嶺管置冰浴中獵靜置5mi餡n；汁向離心管中叮加入890在μLLB番液體培養(yǎng)基鵝置37℃培爆養(yǎng)箱培養(yǎng)9逼0min，率使細菌復蘇窮并表達質(zhì)粒鉗編碼的抗生返素抗性標記株基因；果取培養(yǎng)后的叫菌液200被μL用玻棒恥涂布在含有清100μg洗/mL氨芐境青霉素的L蘋B平板上，列將平板置3媽7℃直至液臟體被吸收后頑將平板倒置樓繼續(xù)培養(yǎng)1折2借-塔16h后禽可出現(xiàn)菌落厭。宅座.3泰陽性克隆菌叨株的篩選及坡鑒定銜將涂布在抗場性平板上長脈出的菌落悉，暈挑取大小適靈中的單菌落乳進行菌落P醫(yī)CR鑒定，穴反應體系如把表2。宜按舊表2所述角體系先加入溜各組分液體幅后混勻，衣再餓分裝在0.復2mLPC恢R管中，每顫管裝25μ鋪L，最后用輕牙簽挑取適鴿量的單菌落抬作為模板，戒PCR反應壤參數(shù)為隱同械竭.1所述，挖有一點不同識就是癢：94仿℃預變性碰需狼5min靠。休反應結束后填取3此μLPCR更產(chǎn)物炸進行0.7令%瓊脂糖凝比膠電泳檢測贊，能夠擴增批出與目的基缸因大小一致夏的DNA片責段初步認為筒是陽性克隆核菌株。顧陽性克隆菌猛株的鑒定乓[邀14均]粉：將初步篩梯選得到的陽活性菌株分別沉接種10m艷LLB液體吼培養(yǎng)基37愁℃這200r/較min培養(yǎng)盈過夜，用質(zhì)扛粒提取試劑澇盒提取質(zhì)粒獸進行酶切鑒畫定，曾酶切體系如蠅表4和表5樹。奮表4單酶漸切曬奧咬享樹駁副棗丙規(guī)表5雙酶叫切感Table覆潛4灑Singl劍eEnz瞎yme-c哨utme編thod撞覺融灑遇繡Table奇排5Do煉uble腹Enzym舌e-cut晚meth丙od聯(lián)試劑名稱勒用量賽試劑名稱纏用量擊10欄×嫩Hbuf群fer痰1.0丹俗μ鳳L慈10瑞×旦Hbuf持fer構1.0櫻寶μ熱L茫質(zhì)粒DNA萍4.0材終μ命L開質(zhì)粒DNA申4.0蒜他μ市L比Bgl世Ⅱ客/饒Sph專Ⅰ安0.5眉μ推L住Bgl萄Ⅱ倚、位Sph權Ⅰ寄各0.5潑μ掠L鐘纏ddH塌2何O俊4.5維μ抵L享ddH跑2暫O壩4.0略μ私L麥T知otal窩volu辭me洲10.0畏μ劈L會T乏otal和volum非e沙10.0腫μ歐L要將上述反應悼體系置37喝℃恒溫培養(yǎng)處箱酶切過夜棚，反應完后沒向各體系中榴加1肢μL映10×lo某ading披buff牲er糟,研將其全部點騾樣到0.7懲%的瓊脂糖消凝膠中進行擊電泳檢測。遇將酶切鑒定婦符合要求的句菌株隨機取毯一個（命名震為KMQZ閘3）送Ta含KaRa寶餅生物公司測慌序。溝邀項表達載體的勤擴增抽由于購買的殘表達載體是露以純質(zhì)粒的界形式提供，困需要將其轉睬入大腸桿菌逝內(nèi)進行擴增矩。故先進行簡表達載體的論常規(guī)轉化，楊再從大腸桿思菌中提取質(zhì)寇粒進行后續(xù)膠試驗操作。厲將購買的表液達載體pH葉IS152葡5（10擔μg沒）用適量的封水（約20成μL哨）溶解后，愚取1μL轉溉化大腸桿菌圓DH5α感景受態(tài)細胞（蒼感受態(tài)細胞耐的制備與轉功化夫方法葬與街E.col緒i否JM10軟9相同），買在含有10眠0μg/m爺L氨芐青霉豬素的LB培既養(yǎng)基上篩選鞋陽性轉化子賊，并通過提種取質(zhì)粒和酶田切進行鑒定亦，將陽性轉砌化子命名為租DH5α-股pHIS寸1525售。約跑贈重組表達載圍體的構建侍1.6腹.5籠.1內(nèi)切研葡聚糖酶基授因（已經(jīng)去爛掉信號肽編團碼序列）的列準備距挑取一環(huán)夜E.col潛i蝦JM109筍（含目的基喚因）在含氨湊芐青霉素的怖LB平板上矛劃線培養(yǎng)過優(yōu)夜，然后挑裹取單菌落接也種10mL噸含相應抗生蔽素的LB液使體培養(yǎng)基，勢37℃劇烈烏振蕩培養(yǎng)1屆2馬-驗14h后，呀按質(zhì)粒提取爆試劑盒說明柏進行質(zhì)粒的矛提取，提取組完后進行瓊境脂糖凝膠電形泳檢測提取妹質(zhì)量和大致品濃度。先將胳質(zhì)粒進行必Bgl=2\*ROMAN假II芝單酶切且，后泉進行撒Sph=1\*ROMAN遙I柜單酶竊切端，弊兩者籌酶切體系與埋方法一致。王酶切完后向棚兩管中加入鐮5.5凍μL相10×lo瘡ading忽buff沸er，最后傭?qū)纱螁蚊釜{切的質(zhì)粒D皆NA進行瓊腹脂糖凝膠電違泳，然后從事凝膠中回收鵲所需要的目筒的條帶，其延方法與PC恢R產(chǎn)物的瓊浩脂糖凝膠回譯收相同，并基取5衣μL第電泳檢測其勺回收的大致閥濃度。葵1.年6確.5或.2表達稅載體的準備前挑取一環(huán)大流腸桿菌DH橫5α（含表嗽達載體質(zhì)粒災）在含氨芐網(wǎng)青霉素的L義B平板上劃騙線培養(yǎng)過夜授，然后挑取譽單菌落接種紀10mL含沈相應抗生素俘的LB液體疫培養(yǎng)基，3鉛7℃劇烈振扒蕩培養(yǎng)12瓶-府14h后，裙按質(zhì)粒提取谷試劑盒操作纖進行質(zhì)粒的籍提取，提取蘆完后進行瓊凝脂糖凝膠電吉泳檢測提取舒質(zhì)量和大致炒濃度。將提尋取的質(zhì)粒進竿行掘Bgl拜Ⅱ攪和舉Sph致Ⅰ位雙酶切標。錦同樣，為了讀保證酶切后這回收的DN怖A濃度，需肚做3管該反肝應體系。將桿上述反應體杰系置駝37溝℃恒溫培養(yǎng)書箱酶切過夜吸，酶切完后醋向管中加入訴5.5啊μL梢10×lo功ading怨buff聰er混合均暫勻，取5尼μL進行電湖泳檢測酶切根情況，將其捐余反應液班進行瓊脂糖灶凝膠電泳，寺然后從凝膠暮中回收所需時要的目的條疼帶，其方法熱與PCR產(chǎn)絞物的瓊脂糖調(diào)凝膠回收相給同，并取5嶺μL聽電泳檢測其白回收的大致撇濃度。蔑1.6.紀5證.3融虜連接及轉化村將已經(jīng)準備訊好的內(nèi)切葡胡聚糖酶基因全與表達載體步按淘表6隆加入進行連喝接反應：土表6連接巧體系吧Table樂添6疏The答liga馬tion辭syste載m緒表達載體偷/掘μL懲目的基婆因/式μL凡T4伶隨DNA季羊ligas郵e維/寨μL降連接buf座fer肚/宿μL曠超純水蹄/褲μL炭總體系嗚/錄μL牢3違5照2單3微2鎖15繭將上述兩個暑連接體系置惕PCR儀中考16℃連接伸過夜，轉化握時分別取1緣0μL連接返液分別轉化豬大腸桿菌D軍H5α感受既態(tài)細胞并涂評布在含有1魂00μg/省mL氨芐青損霉素的LB尤平板上，待防菌落長出后煉，進行菌落吩PCR、酶衣切鑒定瓶[下15,16校]栽。夕2結果與棍分析夸2.1濱泡目的基因的框獲得豐以提取的B距3質(zhì)粒為模走板根據(jù)設計繩合成的引物染進行PCR孤，獲得的P潛CR產(chǎn)物為嶄不含目的基竿因信號肽序恥列的片斷，喬其大小約為截1.5Kb倡，對獲得的悉PCR產(chǎn)物假取3μL進秀行電泳，結棍果見圖短2。集結果表明P鹽CR產(chǎn)物大腔小與目的基捆因大?。?轎500bp接）接近款。醬然后對產(chǎn)物識進行膠回收動，以去掉P課CR體系中合的引物、模蒙板DNA、孩酶等雜質(zhì)，雅使其純度滿集足隨后連接過要求，回收游后取5μL潮進行電泳，壤結果見墾圖憂2萍。誦圖2PC庫R擴增產(chǎn)物狂結果及產(chǎn)物司膠回收租Fig2笛駱Ther阿esult振sof勒PCRa但ndge拉lrec朱laim詳2.2箏筐目的基因的樣克隆楚將膠回收后灑的目的基因適與克隆載體鏡pMD18泛-TVe黃ctor進斜行連接后轉掛化盼E考.異coli頁JM109倡感受態(tài)細胞軋，長出菌落喜后挑取大小澆均一的菌落劇進行菌落P礎CR檢測陽痛性轉化子，瀉菌落PCR評結果呼如闊圖嫁3所示。原醋圖3忍E.col推i炕JM109穴轉化子的菌賴落PCR檢宋測蕉Fig3稱缸賞Ident罵ifica踏tion帶ofre楚combi箏nant相E.col獸i榜JM10糖9by各colon齡yPCR泉從電泳結果販可以看出，仆在挑取的9漁個轉化子中概，有8個轉伏化子通過其竊菌落PCR短后得到與目著的基因的大檢小相一致的刺產(chǎn)物，只有困9號轉化子仇未得到PC爽R產(chǎn)物，說復明它是一個茂假陽性。根殲據(jù)以上菌落獻PCR結果射，在2–8尸號轉化子中爬隨機挑取一療個單菌落（先命為KMQ掙Z3）接種級10mL堡LB液體培把養(yǎng)基（含1繁00μg/忙mL氨芐青得霉素）37扁℃劇烈振蕩寸培養(yǎng)12修-診16h后按學質(zhì)粒提取試笑劑盒操作提有取質(zhì)粒，分揚別取3μL禾和5μL進因行單雙酶切畢鑒定，結果轎如圖圖兆4。提夠抹稅鎮(zhèn)指弓圖4待E.col注i劇JM109撈轉化子的酶香切檢測指Fig4爬Iden壁tific緩ation賓of聽E.col我i籠JM10寺9rec喘ombin毀antb花yres叛trict揚iona壩nalys嘆is紗電泳結果表芽明：通過雙鳥酶切后可以蔬得到與目的償基因大小一泉致的條帶，公但轉化子質(zhì)周粒漁Sph皆Ⅰ單酶切后回發(fā)現(xiàn)了兩條患條帶，和該字質(zhì)粒的雙酶惠切結果一致呆，經(jīng)過分析殲發(fā)現(xiàn)其原因藍是：PCR脊產(chǎn)物與克隆留載體pMD襯18-T烈Vecto消r在連接時堵沒有按目的慌基因的正向愧順序進行連和接，剛好相協(xié)反，目的基工因反向連接駱在了克隆載獅體上，但這冠不影響本試剩驗的后續(xù)試憶驗，酶切結辣果表明目的葬基因已經(jīng)連雁接到了克隆爐載體pMD柿18-T醉Vecto正r上。排2.笨3本表達載體辛的擴增向購買的表達鴨載體是以凍責干的質(zhì)粒形駐式提供，按不操作手冊說棕明需要將其若轉入大腸桿兆菌內(nèi)進行常腔規(guī)的擴增后沸再提取質(zhì)粒愁進行重組操橋作，故先進絲行表達載體連的常規(guī)轉化貨。犁將購買的表另達載體質(zhì)粒聞pHIS1李525（約暴10μg）自用適量的水扒（約20μ乘L）溶解后賊，取1μL訂轉化大腸桿悉菌DH5α渾感受態(tài)細胞攏（感受態(tài)細捷胞的制備與辣轉化與非E炕.扔coli豐JM109喚相同），涂學布在含有1靈00μg/拌mL氨芐青靈霉素的LB附培養(yǎng)基上，媽待長出轉化耳子后（約2霸4h），挑哈取大小均一題的單菌落接歌種10mL頃LB液體紡培養(yǎng)基，碼37℃故劇烈振蕩培旋養(yǎng)12傻-浙16h后按胸質(zhì)粒提取試瞞劑盒操作提危取質(zhì)粒，再替分別取3μ北L和5μL寬進行未酶切奮和單酶切的渠鑒定，電泳鞭結果見圖冠5。詠圖5將表達質(zhì)粒p理HIS15顯25瞧的酶切檢測栽Fig5到Rest葬ricti莖onan今alysi項sof雄thep衫lasmi后dpHI母S1525前電泳結果表身明，未經(jīng)酶超切的pHI村S1525幣質(zhì)粒其分子孩量比實際分事子量（約7臣.4Kb）姓大，但單酶株切后分子量連符合實際大聯(lián)小，其可能術原因是質(zhì)粒呀在復制過程稼中形成敲了鑒質(zhì)粒多聚體斬，單酶切后禁未發(fā)現(xiàn)非特臭異性切割，斯說明該質(zhì)粒五是pHIS煮1525質(zhì)賠粒。同時將恒該轉化子命男為DH5α給-pHIS腐1525。闊2.偏4繼重組表達冊載體的構建嫩2.棄4擦.1霞內(nèi)切葡聚變糖酶基因（蘇已經(jīng)去掉信保號肽編碼序低列）的準備泡通過轉化子猜的菌落PC避R和酶切檢銹測后，發(fā)現(xiàn)派目的基因（霞已經(jīng)去掉信車號肽編碼序煌列）反向連間接在pMD細18-T鴉Vecto涼r克隆載體蝶上，為保證悲隨后的酶切央和表達載體攝的正確連接餡，提取轉化駐子質(zhì)粒后先氧進行疫Bgl至Ⅱ單酶切，熊回收后再進繡行保Sph勝Ⅰ單酶切，貝這樣通過兩妙次單酶切后約保證了目的億基因兩端分套別是由封Bgl弊Ⅱ、設Sph乎Ⅰ酶切后產(chǎn)肝生的粘性末物端，通過兩客次單酶切后柄用膠回收試李劑盒回收目呀的條帶，取么5μL電泳涂檢測其大致尺濃度，結果票見圖稿6。念圖6膠回病收的目的基隊因與臥表達質(zhì)粒p衰HIS15愛25夸蝦悶菌悉蛛Fig準6Re適claim怨edta皮rget豐gene磚andp經(jīng)lasmi噸dpHI球S1525棒尼2.紗4巾.2榮表達載體眉的準備撞含表達載體廊質(zhì)粒pHI混S1525呼的大腸桿菌鉗DH5α在卵含氨芐青霉其素的LB平文板上劃線培舅養(yǎng)過夜，然史后挑取單菌選落接種10疑mL含相指應抗生素的牢LB液體培號養(yǎng)基，37痕℃劇烈振蕩非培養(yǎng)12恒-貧14h后，眾按質(zhì)粒提取沸試劑盒操作丈進行質(zhì)粒p弄HIS15崇25的提取奶，并對質(zhì)粒際進行皆Bgl斥Ⅱ、偵Sph含Ⅰ雙酶切，愁電泳后切取怨目的條帶進派行膠回收，聰并取5μL餅電泳檢測其盛大致濃度，皇結果見圖坦6名。垂2.鉆4三.3蓮轉化子的丙篩選及檢測衡用T4D狐NA連接酶燕連接膠回收誦的目的基因字（即去掉信枯號肽編碼序型列的內(nèi)且葡率聚糖酶基因扔）與表達質(zhì)艷粒pHIS砌1525，扔將連接體系薦置PCR儀雞中16℃連激接過夜，取鮮10μL連貧接液轉化大辱腸桿菌DH枕5α感受態(tài)心細胞并涂布盼在含有10顏0μg/m寇L氨芐青霉梅素的LB平訪板上，待菌綠落長出后，拍挑取菌落大斧小均一的單喝菌落進行菌王落PCR，喚結果見圖盾7。殼菌落PC倚R結果表明越，轉化子3潮、5、6、準7均能得到欲與目的基因邪大小相一致致的條帶。根甚據(jù)電泳結果奇隨機挑取其屈中的一個單圖菌落培養(yǎng)后糕提質(zhì)粒進行扭酶切檢測，狼結果見圖降8。匪鴿臺狗圖7睡E.col棟i秧DH5弟α車轉化子菌落雷PCR寧藏鎖圖8凝轉化子質(zhì)粒默酶切結果昆Fig7辮呢Recom鴿binan瓶t損E.co酬li騾DH5α書colon醋yPCR升仁Fig8竹會Restr柿ictio瞧nana野l(fā)ysis臥ofr退ecomb私inant渠結果表明，不質(zhì)粒經(jīng)過單熄酶切后沒有逆出現(xiàn)非特異載性條帶，雙增酶切后可得庭到與目的基爐因大小相一佛致的條帶，形說明目的基唐因包含的該奸質(zhì)粒中。通今過對轉化子碑進行菌落P造CR及其質(zhì)櫻粒酶切檢測亦，表明重組手質(zhì)粒已經(jīng)轉惡進了大腸桿歡菌DH5α耀中。將該菌擴命為淺pH稱EC-En揪d范。3討論驕3.1念芽孢桿菌啟作為表達體連系化的優(yōu)點你芽孢桿菌為怪革蘭氏陽性掉細菌，細胞猶壁不含內(nèi)毒懸素，能分泌甜大量的蛋白瞧到體外，能非形成芽孢，尖是一些重要聾工業(yè)酶制劑倚的生產(chǎn)菌。浩自1958泛年Spiz篇izen暴[1彼7征]絹發(fā)現(xiàn)枯草桿助菌168菌綿株能攝取外淚源基因以后覽，隨著DN踩A重組技術樹的發(fā)明，特型別是金黃色腐葡萄球菌(襪Staph煌yloco異ccus刺aureu生s獻)帶抗性標矛志的質(zhì)?？珊俗鳛槠漭d體秀的發(fā)現(xiàn)，芽糠孢桿菌基因真工程的工作旗迅速發(fā)展。端作為很有吸賤引力的外源孔基因表達的獎宿主，芽孢背桿菌有以下別一些優(yōu)點:盈除炭疽桿菌每(吳Bacil識lusa訊nthra籍cis評)和蠟樣芽饑孢桿菌(撐Bacil詠lusc都ereus光)等外，多誦數(shù)芽孢桿菌掏對人畜無害緞，不像大腸袍桿菌那樣具茫有熱源性脂帖多糖。里遺傳學現(xiàn)在厚相當先進，靈很多噬菌體良和質(zhì)粒適合中于用作克隆羽載體。駁具有蛋白分反泌能力強的形特性。當分突泌蛋白跨過葬細胞膜后，似就被加工和芬直接釋放到飄培養(yǎng)基中，嘉這使得回收粥和純化目的防蛋白較為簡肥單。示良好的發(fā)酵潛基礎和生產(chǎn)彼技術。芽孢品桿菌在工業(yè)笨上長期被用揮于生產(chǎn)蛋白省酶、a-淀黃粉酶以及蘇堅云金桿菌的早殺蟲晶體蛋爐白等。在相亭對簡單的培野養(yǎng)基中能生算長到很高的服密度。細胞稀的生長特性曾和生理學性萍質(zhì)都被廣泛童、深入研究挽。為經(jīng)過幾十年繳的努力，芽腳孢桿菌表達隨系統(tǒng)的優(yōu)越使性得到發(fā)揮謹，許多原核殼和真核基因委被克隆和表樓達，其中有駕的己應用于袖工業(yè)生產(chǎn)，霞取得了不少未成績。但是暫，用芽孢桿寇菌作為產(chǎn)品抵生產(chǎn)菌也暴棒露出一些問有題:蛋白酶健對目的蛋白材的降解，質(zhì)雀粒的不穩(wěn)定骨，真核蛋白要分泌表達量居低或不能分贏泌表達等。落3.2罵信號肽對外坑源基因表達峰的影響購信號肽對外步源基因分泌邁表達至關重狠要，同一種平蛋白酶在不戒同信號肽的辭作用下，即創(chuàng)使都能分泌斗表達，其分挽泌效率也會噴相差甚遠。貨Yang株Yang慨[18]毫等人研究表原明：當使用砍巨大芽孢桿秋菌的胞外脂被酶的信號肽減代替自身的嚇信號肽時，仰可提高青霉盲素酰胺酶G遼表達量1.舞7倍；Na急garaj碌an訪[踩19究]毛選擇了枯草們桿菌蛋白酶幅、中性蛋白書酶、芽孢桿會菌RNA酶套和果聚糖蔗項糖酶等四種航酶的信號肽栽，以芽孢桿切菌BE15攪10為宿主腰菌，分別研查究它們對重付組鏈霉抗生沈素蛋白分泌爭效果的影響上。結果表明池，攜帶四種黨融合基因的續(xù)菌株都能有預效分泌四聚亭體鏈霉抗生參素蛋白，但襲以用中性蛋苗白酶信號肽洞時效率最高渣。大腸桿菌蓮由于細胞壁夾結構與芽孢旁桿菌不同，盯很少能將外涌源蛋白分泌勸在胞外，大貿(mào)多在胞內(nèi)形扇成包含體的兄形式。在大陡腸桿菌中似翅乎信號肽的支存在對外源苗基因的表達賢存在不利，至如李相前等及[匆20織]胃通過PCR檢方法分別克杜隆菌Cel1刊2B乒完整基因和記不帶信號肽瑞基因至pE習T一20b鑄載體，構建晨重組質(zhì)粒p色ET-20旺b—Cel酒12B和p訪ET一20賺bCel1敞2B-WS塔，轉化至大蓮腸桿菌JM權109DE巡3誘導表達垂后，分析酶先活，結果表拖明去除信號辯肽重組菌單殲位酶活是未仰去除信號肽訴重組菌的1薦1倍多。塑3.3岔引物的設計毛Rygus蒙T杜[插21遮]魔、Yang灶Yang販[央22頸]董均報道球表明，幻外源基因在持表達載傅體輕的信號肽引詠導虹比基因自身挽信號肽引導通下遲具有較高的腫表達水平鋒。Yang洞發(fā)現(xiàn)來自T巴hermo電bifid隊afus午ca的水解馳酶只有其密輸碼子適合巨順大芽孢桿菌澆時才能成功級的表達，黃滋玉杰等方[悅23印]女人在巨大芽同孢桿菌中克子隆到了編碼斤內(nèi)切酶的基豎因，該基因輩片段同己發(fā)午表的枯草芽徑孢桿菌gl窮yB—ap叔rE之間的露同源性為3褲5％；同芽裕孢桿菌BP孟23ce嬸lB、短小簡芽孢桿菌內(nèi)俱切葡聚糖酶耳和多粘芽孢白桿菌β-疤1，4-內(nèi)坡切葡聚糖酶確的編碼基因目的同源性只弓有27％。撥表明巨大芽灣孢桿菌在密照碼偏愛性上喊與其他芽孢伍桿菌存在著薪差別。因此性，在設計引持物時，通過害分析巨大芽綱孢桿菌和編惑碼該基因的辰密碼子使用研頻率，引入評堿基A。使限編碼的內(nèi)切蝦葡聚糖酶能擇夠正確的與蓬表達載體p隙HIS15份25上的信滅號肽融合而購不至改變閱仆讀框漁。在本實驗補中，我們萌通過PCR沖去除聽枯草芽孢桿適菌C-36擔內(nèi)切葡聚糖淺酶基因賠中貪編碼信號肽蟻的序列述。4結論竄棕本實驗成功族去除密枯草芽孢桿叛菌C-36攪內(nèi)切葡聚糖稱酶基因褲中編碼翁信號肽浸的序列，并調(diào)且將挎去除信號肽牧的枯草芽孢眾桿菌C-3沫6內(nèi)切葡聚嚴糖酶基因與隙巨大芽孢桿李菌表達載體含pHIS1慢525進行銷連接，準成功嬌構建低了尚重組表達載怪體懷。參考文獻攻[1]護謝占玲，伶吳潤.纖維及素酶的研究轉進展.草業(yè)撐科學[J]遲,2004沒,21（4嗎）予:72-寄75.躲[將2弦]飛喚徐昶，龍敏皮南，鄔小兵佛等.柔高產(chǎn)纖維素榴酶菌株的篩導選及產(chǎn)酶條理件研究洪[J]疑.廈門大學指學報（自然晴科學報），促2005，凡44（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