血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳

血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳第1頁/共25頁蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)是生物大分子化合物，具有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點(diǎn)蛋白質(zhì)分離純化的方法主要有：鹽析、透析、超離心、電泳、離子交換層析、分子篩層析等方法。第2頁/共25頁透析第3頁/共25頁超速離心第4頁/共25頁凝膠過濾層析第5頁/共25頁離子交換層析第6頁/共25頁電泳技術(shù)的原理電泳蛋白質(zhì)在一定的pH溶液中可帶有電荷，成為帶電顆粒，在電場中向相反的電極方向泳動(dòng)。由于蛋白質(zhì)的分子量和電荷量不同，其在電場中的泳動(dòng)速率也不同，從而將蛋白質(zhì)分離成泳動(dòng)速率快慢不等的條帶。電荷的來源蛋白質(zhì)帶有可解離的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的兩性電解質(zhì)，在一定PH條件下會(huì)解離帶上電荷COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr ╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI第7頁/共25頁遷移率電場力F=EQ（E：電場強(qiáng)度，Q：電荷)阻力F=6πγηυ（γ：半徑，η：介質(zhì)粘度）υ/E表示單位電場強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，稱為遷移率，也稱位泳動(dòng)度，以μ表示：μ=υ/E=Q/πγη

可見，離子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)，即其所帶的電荷和形狀。不同的粒子有不同的遷移率，因此電泳一定時(shí)間就可分開它們。第8頁/共25頁樣品性質(zhì)

與分離樣品所帶電荷成正比，與樣品相對分子質(zhì)量成反比。電場強(qiáng)度

電壓越高，帶點(diǎn)粒子移動(dòng)越快。緩沖液的性質(zhì)

緩沖液的PH值距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)指點(diǎn)所帶靜電荷越多，遷移速度越快；反之越慢。離子強(qiáng)度等于1/2∑cizi2支持介質(zhì)

理想電泳支持介質(zhì)應(yīng)是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、不帶電荷、對被分離物質(zhì)無吸附作用的惰性材料。溫度

影響電泳分離效果的因素第9頁/共25頁電泳的分類1、根據(jù)固體支持物種類的不同

紙質(zhì)電泳醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳2、根據(jù)電泳裝置不同

薄膜電泳垂直板電泳平板電泳垂直圓盤電泳第10頁/共25頁醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為支持物的電泳。醋酸纖維素是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經(jīng)乙酰化而成。具有色帶清晰，分辨率高；成本低廉，簡介快速；樣品用量少，靈敏度高，臨床檢驗(yàn)應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。醋酸纖維素薄膜電泳第11頁/共25頁瓊脂糖凝膠電泳瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場力作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)電滲作用，因此用于作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠電泳具有：操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳；電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好；可直接用于紫外檢測；易染色易洗脫等優(yōu)點(diǎn)。尤其適合核酸的分離。瓊脂糖凝膠電泳第12頁/共25頁聚丙烯酰氨凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握電泳的基本原理，了解電泳儀、電泳槽的基本結(jié)構(gòu)與功能。

2、熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本過程。第13頁/共25頁實(shí)驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個(gè)組分。因此適用于不同相對分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。根據(jù)有無濃縮效應(yīng)可分為：連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)，其中不連續(xù)系統(tǒng)因具有濃縮效應(yīng)，分離條帶清晰度及分辨率較佳應(yīng)用更為廣泛，本次試驗(yàn)應(yīng)用的為不連續(xù)系統(tǒng)。第14頁/共25頁三大效應(yīng)濃縮效應(yīng)：濃縮膠的濃度小于分離膠的濃度，因凝膠孔徑的不連續(xù)使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)域，從而提高分離效果。緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性也能造成濃縮效應(yīng)：電極緩沖液通常為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，樣品及凝膠（濃縮膠）中緩沖液為pH6.7Tris-HCL緩沖液。電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮。1cm厚樣品層可以壓縮0.25μm的厚度。分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電荷越多遷移越快第15頁/共25頁不連續(xù)系統(tǒng)成分pH值孔徑電泳緩沖液甘氨酸(慢離子)8.3樣品蛋白質(zhì)6.7濃縮膠Cl-(快離子)6.7大分離膠Cl-(快離子)8.9小有效遷移率=遷移率解離度氯離子>蛋白質(zhì)陰離子>甘氨酸陰離子第16頁/共25頁垂直板電泳的優(yōu)點(diǎn)：表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰?？啥鄠€(gè)樣品的電泳膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高。膠版薄而透明，可制成干板，便于長期保存與掃描。可進(jìn)行雙向電泳。血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳中，只可以分離出5~6條區(qū)帶，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中可分離出數(shù)十條區(qū)帶。第17頁/共25頁實(shí)驗(yàn)器材與試劑器材圓盤電泳槽、電泳儀、脫色搖床、染缸、微量加樣器、注射器、小燒杯試劑（緩沖液PH值準(zhǔn)確配置后用PH計(jì)調(diào)試）試劑編號(hào)試劑名稱配置14*分離膠緩沖液1mol/L鹽酸24.0mL/100mL,Tris18.2g/100mL(pH8.9)230%單體交聯(lián)劑丙烯酰胺30.0g與甲叉雙丙烯酰胺0.8g100mL3催化劑10%過硫酸銨（臨用前配置）4加速劑TEMED1mL加蒸餾水到10mL54*濃縮膠緩沖劑mol/L鹽酸48mL/100mL,Tris5.98g/100mL(pH6.7)610*電極緩沖劑甘氨酸28.8g與Tris6.0g加蒸餾水至100mL稀釋(pH8.3)臨用前十倍稀釋72*上樣緩沖劑溴酚藍(lán)0.05g20mL甘油，加5號(hào)試劑25mL，定溶至100mL8固定液三氯乙酸12.50g加蒸餾水至100mL9考馬斯亮藍(lán)R250染色液1.25g考馬斯亮藍(lán)R250,溶于227mL甲醇中加蒸餾水227mL冰醋酸46mL10脫色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合第18頁/共25頁實(shí)驗(yàn)操作凝膠柱的準(zhǔn)備（凝膠溶液配制表見教材表4-4）取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)加入蒸餾水制備分離膠應(yīng)迅速為了使表面平整，與空氣隔絕靜置待凝膠聚合濃縮膠制備(1cm)吸取上表面蒸餾水待凝膠與水面的界面重新可辨切勿觸動(dòng)膠面參見分離膠加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口第19頁/共25頁裝柱

將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)第20頁/共25頁加樣

取血清12μL，7號(hào)試劑12μL混勻，品均加入4管，每管6μL.（加樣槍不可插入過深，以免刺破凝膠，同時(shí)要緩慢、均勻，以免攪動(dòng)緩沖液引起樣品擴(kuò)散。）電泳

接通電源，上負(fù)下正，先調(diào)節(jié)電流1mA/管，待示蹤染料進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)為2~3mA/管，待示蹤染料離管下口0.5cm時(shí)切斷電源。剝膠

注入蒸餾水做潤滑劑，針頭螺旋式前進(jìn)，緩緩剝離。固定、染色及漂洗將凝膠柱浸入8號(hào)劑中泡10min，進(jìn)行固定，用9號(hào)劑染色10min，用清水沖洗，放入10號(hào)劑中漂洗脫色。第21頁/共25頁結(jié)果示意圖γβα2α1第22頁/共25頁注意事項(xiàng)：丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶