分子生物學(xué)分子克隆技術(shù)

參考書(shū)目資料《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）：美J.薩姆布魯克等著,黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2008.《GeneIX》：BenjaminLewin編著.《基因工程原理》：吳乃虎，科學(xué)出版社，1998.《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》：郜金榮，葉林柏，武漢大學(xué)出版社，2007.《基因工程》：張惠展，華東理工大學(xué)出版社，2005.目前一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)分子克隆目前二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)目前三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計(jì)并實(shí)施一項(xiàng)把一個(gè)生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物，最終實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價(jià)值?；蚬こ痰幕咎攸c(diǎn)是，分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程目前四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)重組DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。重組DNA技術(shù)，又稱為基因或分子克隆技術(shù)，是基因工程的核心技術(shù)。該技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟。基因工程的核心技術(shù)是DNA重組技術(shù)目前五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)分子克隆技術(shù)

又稱為重組DNA技術(shù)，是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。目前六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)重組DNA操作一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；（3）用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。目前七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)獲得需要的目的基因（外源基因）獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫(kù)(genelibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。目前八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因文庫(kù)的構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序目前九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。目前十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)基因工程的工具酶“手術(shù)刀”專司切割之職，內(nèi)切酶“縫紉針”具有連接之功，連接酶“復(fù)印機(jī)”行使復(fù)制之責(zé)，DNA聚合酶目前十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)(“交通工具車子”)——載體有了切割與縫合（ligase）基因DNA的工具，還得有一個(gè)“車子”將重組DNA送到宿主細(xì)胞中去。

目前十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄酶使真核基因的制備成為可能。

（1）真核基因組龐大而復(fù)雜，不易制得基因圖譜。（2）即使有了基因圖譜，因?yàn)檎婧嘶蛴袃?nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出mRNA，沒(méi)有成熟的mRNA就不能得到相應(yīng)得產(chǎn)物。（3）經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA→cDNA(complementoryDNA)得到的cDNA文庫(kù)要比基因組文庫(kù)小得多，所以篩選陽(yáng)性克隆就方便得多。

目前十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)四、分子克隆的技術(shù)支撐核酸凝膠電泳技術(shù)核酸分子連接技術(shù)細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)DNA序列分析技術(shù)寡核苷酸合成技術(shù)基因定點(diǎn)突變技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)DNA序列測(cè)定技術(shù)目前十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)核酸凝膠電泳目前十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)細(xì)菌轉(zhuǎn)化技術(shù)（包括感受態(tài)細(xì)胞制備）目前十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)目前十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)野生細(xì)胞野生細(xì)胞分離工程酶分離工程基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程

工程細(xì)胞發(fā)酵工程酶工程細(xì)胞工程生物活性物質(zhì)目前十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)目前十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)

用攜帶了外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，發(fā)育成具有新性狀的完整植株——轉(zhuǎn)基因植物。

目前二十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)基因工程的工具酶“手術(shù)刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復(fù)印機(jī)”行使復(fù)制之責(zé)內(nèi)切酶連接酶聚合酶目前二十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)內(nèi)切酶“手術(shù)刀”專司切割之職“縫紉針”具有連接之功“復(fù)印機(jī)”行使復(fù)制之責(zé)內(nèi)切酶連接酶聚合酶目前二十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)內(nèi)切酶目前二十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)同裂酶(Isoschizomers）目前二十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)同尾酶目前二十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)星活性*所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應(yīng)條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來(lái)認(rèn)識(shí)序列不同的位點(diǎn)的現(xiàn)象，也就是說(shuō)產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識(shí)別位點(diǎn)，還可以切斷非特異性的位點(diǎn)。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。Differenceswhichcanleadtostaractivityincludelowionicstrength,highpH,andhigh(>5%v/v)glycerolconcentrations.HighFidelity(HF)RestrictionEnzymescanbeusedtoreducestaractivity.目前二十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)目前二十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)DNA聚合酶Taq酶 用Taq酶擴(kuò)增DNA時(shí)常使片段3‘端凸出一個(gè)A。Pfu酶 產(chǎn)生平末端產(chǎn)物。目前二十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)連接酶T4DNALigase(invitrogen)16°C過(guò)夜或者室溫1-2個(gè)小時(shí)了連接即可。目前二十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)基因工程的載體---用于擴(kuò)增目前三十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)克隆載體必備條件（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)（4）具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)。目前三十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)表達(dá)型基因工程的載體----以PET32為例目前三十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)多克隆位點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)宿主要考慮宿主菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性大腸桿菌不同密碼子的偏愛(ài)性問(wèn)題，將64組密碼子分為強(qiáng)、中、弱密碼子目前三十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)目的產(chǎn)物目的基因不溶性的高效表達(dá)過(guò)程：目的基因編碼的真核蛋白質(zhì)與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結(jié)合在一起，這種結(jié)合在一起的形成的不溶性無(wú)活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與β-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點(diǎn)：避免細(xì)菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量。缺點(diǎn)：需要經(jīng)過(guò)溶解和復(fù)性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物目前三十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)目的基因的高效分泌表達(dá)概念：目的蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)和目的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后再分泌到細(xì)胞外優(yōu)點(diǎn)：①防止宿主菌對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解；②有利于蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象③減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷④有利于分離需要在質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)加入一段信號(hào)肽基因目前三十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)基因克隆操作過(guò)程目前三十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)克隆示意圖目前三十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)克隆示意圖目前三十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)克隆技術(shù)流程分切連轉(zhuǎn)篩目前四十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)分分離（來(lái)自生物組織）、擴(kuò)增（設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增）mRNA-------DNA------擴(kuò)增目前四十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)引物設(shè)計(jì)與訂購(gòu)酶切位點(diǎn)雙酶切、保護(hù)堿基、最合適的緩沖液。引物訂購(gòu)目前四十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)保護(hù)堿基目前四十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)1.用限制性酶消化

DNA樣品目前四十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)單酶切目前四十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)雙酶切目前四十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)選擇合適的雙酶切緩沖液目前四十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)2.用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA目前四十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)3.連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物目前四十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)連接前最好要定量連接比例摩爾比例為： 插入片度：質(zhì)粒=10:1---5:1為佳。質(zhì)粒幾十個(gè)ng為佳。目前五十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)雙酶切EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。目前五十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)冷循環(huán)器目前五十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)4.用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)菌有兩個(gè)基本方法。一是

化學(xué)法，即用CaCl2

處理并加熱激以促進(jìn)DNA進(jìn)入菌體；二是電激法，即

施加短脈沖的電荷以促進(jìn)DNA吸收。目前五十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化目前五十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)用氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化目前五十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)電激轉(zhuǎn)化目前五十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)一個(gè)電激轉(zhuǎn)化程序加50-200ngDNA到40ul電激感受態(tài)細(xì)菌中將混合物放入一個(gè)預(yù)冷的電激杯中施以脈沖電處理，脈沖長(zhǎng)度預(yù)期值為8to12ms立即加1mlLB培養(yǎng)液，在室溫下振蕩2-4小時(shí)。

分別取10ul和100ul涂布在到兩個(gè)加有抗菌素的LB瓊脂平板上，保溫培養(yǎng)1天。目前五十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)5.

細(xì)菌在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)以進(jìn)行篩選連接會(huì)有三種結(jié)果，一是要插入的序列自連；二是切開(kāi)的質(zhì)粒重連；三是要插入的序列與質(zhì)粒相連。第一種連接結(jié)果沒(méi)有菌落形成。第二種連接結(jié)果表現(xiàn)為藍(lán)色菌落。只有后一種結(jié)果是符合需要的，產(chǎn)生白色的抗氨芐青霉素菌落。目前五十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)滅菌器目前五十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)加IPTG和X-GAL目前六十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)倒平板目前六十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)

α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18目前六十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)篩選結(jié)果藍(lán)菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達(dá)出由完好的α

LacZ序列編碼的功能性的

α

片段。白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上α

LacZ序列上有插入片段。目前六十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)乳糖和誘導(dǎo)物IPTG的化學(xué)結(jié)構(gòu)isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside目前六十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)X-galX-Gal是β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色檢測(cè)以及藍(lán)白斑篩選。

目前六十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)X-gal水解目前六十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)篩選結(jié)果模式圖目前六十七頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)藍(lán)菌落建議用DH5α做宿主菌。

目前六十八頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)藍(lán)白菌落目前六十九頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)電泳儀目前七十頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)經(jīng)過(guò)雙酶切、PCR等鑒定，送陽(yáng)性克隆測(cè)序。提取正確的克隆菌中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)型的菌株，如BL21等。誘導(dǎo)表達(dá)蛋白目前七十一頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)鑒定方法目前七十二頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)

PCR鑒定目前七十三頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)

原位雜交目前七十四頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法目前七十五頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)蛋白質(zhì)的純化目前七十六頁(yè)\總數(shù)八十一頁(yè)\編于三點(diǎn)謝 謝！目前