常見酶切位點

常見酶切位點第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一引物設計基本原則引物長度（primerlength）產(chǎn)物長度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚體及發(fā)夾結構（duplexformationandhairpin）閱讀框第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一2.產(chǎn)物的長度擴增片段長度為100~600堿基對.第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度.如果引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度.Tm=2(A+T)+4(C+G)第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一4.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一5.引物自身

引物間3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一任務用綠色熒光蛋白(GFP)標記蛋白NR1第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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NR1的編碼序列(~4000bp)紅色為信號肽,藍色為BamHI酶切位點,下劃線標出酶切位點的閱讀框第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一引物要求PCR擴增GFPGFP兩邊添加BamHI酶切位點保證NR1的閱讀框不改變第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：擴增GFP基本序列變性,引物復性第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一第三步：酶切位點Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期一第四步：閱讀框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

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