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文檔簡介
流式細胞術(shù)貝克曼第1頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一1.檢測淋巴細胞亞群,監(jiān)測細胞免疫狀態(tài)2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系4.干祖細胞的定量及成分分析.5.其它:粘附分子;TCR多態(tài)性檢測;腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細胞內(nèi)酶;耐藥蛋白的分析等等。第2頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一
臨床應(yīng)用疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)免疫調(diào)節(jié):細胞因子/受體的相互作用共刺激分子受體/配體的相互作用
發(fā)病機理:腫瘤的發(fā)病與機體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關(guān)藥物/疫苗效果的評價:腫瘤生物治療的時機選擇、以及效果的監(jiān)測免疫狀態(tài)評價:移植、放化療等.第3頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一細胞周期分析:在細胞周期(G0,G1,S,G2,M)的各個時期,DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標記DNA,并由流式細胞儀進行分析,可以得到細胞各個時期的分布狀態(tài),計算出G0/G1%,S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等,對細胞周期進行精確的分期:G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細胞周期分析第4頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一G2MG0G1s0
200
400
600
8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle第5頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一1.腫瘤的早期診斷。2.腫瘤的良惡性判斷。3.觀察細胞的增殖狀態(tài)及周期分布。4.療效監(jiān)測第6頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一細胞功能分析
1.吞噬功能試驗
2.氧爆發(fā)試驗3.根據(jù)T淋巴細胞分泌細胞因子的不同將CD4+或CD8+分為介導(dǎo)細胞免疫的I型細胞和介導(dǎo)體液免疫的II型細胞.4.藥物泵的功能檢測
5.NK細胞的腫瘤殺傷活性檢測6.血小板的粘附,聚集功能檢測第7頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一樹突狀細胞分析(DendriticCells,DC)DC是主要的抗原遞呈細胞,同時又是重要的先天免疫細胞,還是具有免疫調(diào)控功能的一個細胞群,沒有發(fā)現(xiàn)特異性的抗原標記DC研究的主要內(nèi)容包括直接分析計數(shù)、體外誘導(dǎo)檢測,一般分為兩群-PDC,MDC當(dāng)前DC檢測的方法:1)Lin-,CD11c,CD123,同時可能表達CD80,CD86,CD83,DR等2)利用BDCA1,2,3,4對外周血或其它組織DC進行分析3)CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123第8頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一T細胞分析相對計數(shù)-淋巴細胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正?;蛟龈呓档徒档湍[瘤降低降低增高降低降低第9頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一CD4細胞絕對計數(shù)對AIDS病人的診斷、療效和預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義,一般認為CUTOFF值為200/ul.絕對計數(shù)是加入濃度已知的標準微球與標本一起測定,流式細胞儀控制軟件在設(shè)置后能自動計算出濃度對任何細胞群體都可以進行絕對計數(shù)第10頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一Th1Th2細胞因子分泌細胞測定根據(jù)產(chǎn)生的細胞因子的類型和生物學(xué)功能,人的CD4+T細胞可以分為Th1、Th2Th1細胞產(chǎn)生IL2、IL12、IFNγ、TNFβ等細胞因子,主要參與細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、遲發(fā)性過敏反應(yīng),并在清除病毒等細胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用Th2細胞分泌IL4、IL5、IL6、IL10、IL13等細胞因子,主要促進體液免疫反應(yīng),中和胞外病原體相應(yīng)地,CD8+T細胞也可以分為Tc1和Tc2Th1細胞:介導(dǎo)細胞免疫、細胞毒性T細胞的生長和活化、巨噬細胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進將導(dǎo)致炎癥慢性遷延,器官特異性自身免疫病,急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細胞:介導(dǎo)體液免疫,促進B細胞的生長、活化和分化,是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子,其功能亢進將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng),參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細胞增多癥。第11頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一Th1Th2檢測Tips一定要確定T細胞是否已經(jīng)活化,細胞轉(zhuǎn)運阻滯是否成功,胞膜打孔是否有效第12頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一一定要用胞漿內(nèi)同型對照(特別是FITC標記時),以便分別部分弱表達的細胞因子。第13頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一TETRAMER抗原遞呈細胞(APC)攜帶抗原片段通過與TCR復(fù)合物結(jié)合,在APC和T細胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T細胞并產(chǎn)生細胞免疫效應(yīng)。MHC-四聚體染色技術(shù)用于抗原特異性T細胞分析的原理在于體外模仿上述抗原遞呈的過程來實現(xiàn)對特異性T細胞的鑒定,通過流式細胞儀這種高通量分析儀器對標本中這群細胞進行分析
四聚體技術(shù)的優(yōu)勢是:可以對特異性免疫細胞進行定量;用流式細胞儀檢測可以快速測定大量細胞,可以同時進行其它表面染色,可以直接用外周血測定而不需要培養(yǎng);四聚體染色不會殺傷細胞,因此染色后的細胞可以進行分選或其它功能分析;四聚體對所有的特異性T細胞都能夠結(jié)合,而不僅僅是對有功能的細胞進行檢測。不同廠家的MHC四聚體產(chǎn)品不太一樣:貝克曼庫爾特公司創(chuàng)造性地構(gòu)建和表達了MHC分子α3鏈的區(qū)域突變的蛋白(iTAg),能降低其與非特異性T細胞結(jié)合,大大提高了特異性。并且將MHC四聚體直接標記熒光,和常用的抗原多肽負載后整體商品化,也有單獨的MHC分子(iTAg)單獨出售,極大方便了研究者第14頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一第15頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一CD4CD25Treg調(diào)控性T細胞的主要功能是抑制機體免疫功能,太強則免疫耐受,太弱會引起自身免疫反應(yīng)調(diào)控性T細胞調(diào)節(jié)抗原遞呈細胞對抗原的遞呈調(diào)控性T細胞的表型是CD4+CD25bright,逐漸發(fā)現(xiàn)越來越多的其它分子可能能夠更精確限定(eg.FOX-1?)CD25也是免疫細胞晚期活化的標記,但表達的平均熒光強度不足夠強第16頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一非特異性的先天免疫細胞δT細胞:占外周血T細胞的10%以下,非抗原依賴型免疫細胞,在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加,表達CD3量較普通T細胞多NK細胞:占外周血淋巴細胞8-25%,傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細胞可以根據(jù)NKR的不同而分類,丙型肝炎的發(fā)生和預(yù)后可能與NK細胞的表型相關(guān)DC:分布與淋巴組織和外周血,為非成熟狀態(tài),遇到相應(yīng)的抗原后主要分泌IFN-alpha來發(fā)揮左右第17頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一其它重要分子的流式分析的意義粘附分子:物種間高度保守,與細胞間通訊,干細胞HOMING,腫瘤的發(fā)生可能有很重要的關(guān)系,如CD11C/CD18-CD54與DC成熟和遷移有關(guān);CD209-CD102與抗原遞呈有關(guān)CD26:移植后造血干細胞表達可能不利于該細胞的homing,有證據(jù)表明抑制造血干細胞有利用移植成功第18頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一流式細胞術(shù)在移植中的應(yīng)用移植配型和群體反應(yīng)性抗體的檢測熒光示蹤標記的移植細胞:CFSE是一個確定的熒光標記物,開發(fā)其它穩(wěn)定的熒光素應(yīng)該更有幫助第19頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一流式細胞儀分選為達到最高的分選效率,實用中最好先用磁珠分選系統(tǒng)進行初步分選活細胞分選非常有用第20頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一流式細胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究的新方向細胞多態(tài)性分析:受體、抗原折疊、HLA等,包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(與AIDS易感性有關(guān)),NKR(中國科大研究領(lǐng)先項目)信號傳導(dǎo)(實際主要為胞漿內(nèi)磷酸化及去磷酸化蛋白的檢測)新型熒光特異性探針:胞內(nèi)病原體檢測、轉(zhuǎn)錄因子檢測、細胞器或細胞生命活動指標的新熒光素的應(yīng)用利用分選的細胞進行體內(nèi)和體外功能研究與其它定位性的熒光設(shè)備聯(lián)合使用(如MPE,CONFOCAL,IC100等)第21頁,共23頁,2023年,2月20日,星期一CellLabIC100Completed
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