基因工程導論課件

基因工程曹永長教授生物技術生物技術(Biotechnology)是一門新興的綜合的學科,有時也稱生物工程(Bioengineering)，是指人們以現(xiàn)代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他學科的技術原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的。生物技術的種類1、基因工程(geneengineering)2、細胞工程(cellengineering)3、酶工程(enzymeengineering)4、發(fā)酵工程(fermentationengineering)5、蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)基因工程應用人工方法把生物的遺傳物質(zhì)(DNA)分離出來,在體外進行切割、拼接和重組。然后將重組了的DNA導入某種宿主細胞或個體,從而改變它們的遺傳品性;有時還使新的遺傳信息在新的宿主細胞或個體中大量表達，以獲得基因產(chǎn)物(多肽或蛋白質(zhì))。這種創(chuàng)造新生物并給予新生物以特殊功能的過程就稱為基因工程,又叫DNA重組技術。基因克隆（genecloning），DNA克?。―NAcloning），分子克?。╩olecularcloning)，基因工程（geneengineering），遺傳工程（geneticengineering）等術語常與重組DNA技術通用。基因工程理論依據(jù)1、不同基因具有相同的物質(zhì)基礎。2、基因是可以切割的。3、基因是可以轉(zhuǎn)移的。4、多肽與基因之間存在對應關系。5、遺傳密碼是通用的。6、基因是可以遺傳的。遺傳物質(zhì)——DNA中心法則DNA是遺傳信息的一級載體，能夠被轉(zhuǎn)錄成RNA，并進行蛋白質(zhì)的合成，這就是遺傳信息流。

DNARNA蛋白質(zhì)瞧這一家子！ProkaryoticcellEukaryoticcell兩種動物性別決定基因的部分比較人與鯨的外形十分不同，但他們?nèi)匀挥纱篌w上相同的蛋白質(zhì)組成。盡管人與鯨的分化時間已經(jīng)很長，但他們許多基因的核苷酸序列還非常相似。圖中展示了人與鯨中編碼雄性決定蛋白基因的一部分序列，陰影部分是兩者完全相同的部分。各種生物共享相同的分子機制圖中顯示嬰兒及小鼠的前額部都有相似的白班，因為他們各自的kit基因都有缺陷。色素細胞的發(fā)育和存活都需要這個基因?；蚬こ萄芯堪l(fā)展史準備階段：1944年，Avery等通過細菌轉(zhuǎn)化研究，證明DNA是基因載體。1953年，Watson和Crick建立DNA分子的雙螺旋模型。1958—1971，確立中心法則，破譯64種密碼子。1960—1970，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶。1972年，首次構建重組DNA分子?；蚬こ萄杆侔l(fā)展階段（1）1980—1990年代，基因工程基礎研究趨于成熟，發(fā)展了一系列新的基因操作技術，構建了多種載體，獲得了大量轉(zhuǎn)基因菌株。（2）1980年培育第一個轉(zhuǎn)基因動物——超級鼠。（3）1983年培育出第一例轉(zhuǎn)基因植物——轉(zhuǎn)基因煙草。（4）大量的基因工程藥物研究成功?；蚬こ痰幕境绦蚍帧d體和目的基因的分離切—限制性內(nèi)切酶接—載體與目的基因連接成重組體轉(zhuǎn)—基因序列轉(zhuǎn)入細胞篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定分—載體和目的基因的分離

目的基因的來源和分離基因文庫cDNA文庫人工化學合成聚合酶鏈(PCR)反應切—限制性內(nèi)切酶的應用限制性內(nèi)切酶

（restrictionendonuclease）

該酶有三類，即限制性內(nèi)切酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。實際工作應用的為限制性內(nèi)切酶Ⅱ，它能識別和切割雙鏈DNA的特異順序，產(chǎn)生特異的DNA片段。Ⅱ型具有嚴格的識別、切割順序。它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5′端為P，3′端為OH。識別順序一般為4-6個堿基對。不同限制性核酸內(nèi)切酶

切割的三種情況產(chǎn)生3′突出粘性末端（cohesiveend):以EcoRI為例：

5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CATAAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′產(chǎn)生5′突出粘性末端:以PstI為例：

5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG---3′3′---GACCTC---5′PstI3′---GOHpACGTC---5′產(chǎn)生平末端（bluntend):以NruI為例：

5′---TCGCGA---3′5′---TCGpOHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′DNA連接酶

T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶：MW=68kD，催化兩個獨立DNA片段5′磷酸基與3′羥基之間形成磷酸二酯鍵篩—目的基因序列克隆的篩選和鑒定

按重組載體的標志進行篩選核酸雜交法核苷酸序列測定PCR免疫學方法DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析基因克隆的載體

載體（vector）是攜帶靶DNA片斷進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。載體的本質(zhì)是DNA，具備以下特征：自主復制；有篩選標記；適當大小的分子量適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切位點；在細胞中拷貝數(shù)高。

質(zhì)粒載體（plasmid）

載體噬菌體載體（bacteriophage）質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀DNA。質(zhì)粒DNA在細菌中的復制有兩種類型，即嚴緊型和松馳型，后者為高拷貝質(zhì)粒，常用于基因克隆實驗。常用的質(zhì)粒載體有pBR322，pUC18和pUC19。噬菌體載體-噬菌體載體：gt10、gt11、EMBL4、粘粒載體M-13噬菌體載體T4噬菌體載體噬菌體載體

插入載體(Subsitutionvector):

gt10和gt11，只有單一的EcoRⅠ酶切位點，只容許幾個kB的外源DNA插入。此類載體主要同于cDNA文庫的構建。

替代載體（replacevector)：EMBL4，含有EcoRⅠ(E)、SalⅠ(S)和BamHⅠ(B)三個限制性內(nèi)切酶位點。酶切后可用外源性DNA取代。指入片段長度為9-22kb。主要用于構建基因組文庫。M13噬菌體載體

M13噬菌體含約64kb的單鏈閉環(huán)DNA分子。在菌細胞內(nèi)形成過度階段的雙鏈環(huán)狀復制型DNA（RF）。雙鏈外源DNA可插入到M13噬菌體，雙鏈復制型DNA中并進行高拷貝復制。亦很容易地從感染細胞中純化得到并重新導入宿主細胞，進入宿主細胞后，這種雙鏈DNA很快又重新進入復制周期，產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。子代噬菌體DNA是單鏈的，只含有外源DNA的一條鏈。

主要用于DNA測序和制備單鏈放射性探針

利用T4噬菌體頭部表面的非必需外殼蛋白，將目的蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。具有操作方便、容量大、拷貝數(shù)高，表達產(chǎn)物保持相對獨立的空間構象和生物學活性、易于分離、免疫原性強等優(yōu)點。T4噬菌體表面蛋白展示系統(tǒng)T4噬菌體表面蛋白展示系統(tǒng)

質(zhì)粒表達系統(tǒng)：表達質(zhì)粒大腸桿菌噬菌體展示系統(tǒng)：缺失突變型T4-Z1整合質(zhì)粒大腸桿菌T4噬菌體表面蛋白展示系統(tǒng)SOCgp23SOC-VP2SOCgp23surfacelatticeabc基因工程研究內(nèi)容基礎研究應用研究基礎研究（1）基因工程克隆載體研究（2）基因工程受體系統(tǒng)研究（3）目的基因研究（4）基因工程工具酶研究（5）基因工程新技術研究應用研究（1）新藥開發(fā)（2）轉(zhuǎn)基因植物（3）轉(zhuǎn)基因動物（4）其他方面——酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學與能源工業(yè)、環(huán)境保護等新藥開發(fā)1、抗生素：6000多種抗生素，其中約100種被廣泛使用，每年市場銷售額約100億美元。利用重組DNA技術，提高抗生素產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。2、激素：生長激素、生長激素釋放抑制激素、胰島素、心鈉素等。3、其他藥物：干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子等。用基因工程方法生產(chǎn)的部分人類蛋白質(zhì)藥物（1）蛋白質(zhì)名稱用途a1抗胰蛋白酶治療肺氣腫促腎上腺皮質(zhì)激素治療風濕B細胞生長因子治療免疫系統(tǒng)功能失調(diào)降鈣素治療軟骨病集落刺激因子治療血液病、腫瘤輔助治療絨毛膜促性腺激素治療不排卵癥內(nèi)啡肽和腦啡肽鎮(zhèn)痛劑上皮生長因子促進傷口愈合紅細胞生成素治療貧血用基因工程方法生產(chǎn)的部分人類蛋白質(zhì)藥物（2）蛋白質(zhì)名稱用途凝血因子VIII治療血友病凝血因子IX治療血友病生長激素促進生長生長激素釋放因子促進生長胰島素治療糖尿病干擾素抗病毒、抗腫瘤白細胞介素治療癌癥淋巴細胞毒素抗腫瘤巨嗜細胞激活因子抗腫瘤用基因工程方法生產(chǎn)的部分人類蛋白質(zhì)藥物（3）蛋白質(zhì)名稱用途神經(jīng)生長因子促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復血小板衍生因子治療動脈粥樣硬化松弛素助產(chǎn)劑血清白蛋白血漿補充物生長調(diào)節(jié)素生長調(diào)節(jié)素組織型纖溶酶原激活劑溶栓劑腫瘤壞死因子抗腫瘤尿抑胃素抗?jié)兯幬锬蚣っ溉芩▌┪覈雅鷾噬鲜械幕蚬こ趟幬锩Q適應癥重組人干擾素a1b(外用)病毒性角膜炎重組人干擾素a1b乙肝、丙肝等重組人干擾素a2a尖銳濕疣、皰疹、乙肝、丙肝等重組人干擾素a2b乙肝、丙肝重組人干擾素-r類風濕、癌癥輔助治療重組人白細胞介素-2癌癥輔助治療重組人粒細胞集落刺激因子化療生白細胞重組人紅細胞生成素再生障礙性貧血堿性成纖維細胞生成因子創(chuàng)傷、燒傷基因工程與疫苗甲型、乙型病毒性肝炎疫苗腸道傳染病疫苗（霍亂、痢疾等）寄生蟲疫苗（血吸蟲、瘧疾等）流行性出血熱疫苗、EB病毒疫苗等愛滋病毒疫苗避妊疫苗：精子避妊疫苗、激素類避妊疫苗轉(zhuǎn)基因的定義轉(zhuǎn)基因動物Transgenicanimal

–在受精卵時進行基因轉(zhuǎn)移，使最后獲得含有外源基因的動物，獲得新基因的特性雜合動物Chimericanimal

–采用胚胎干進行基因轉(zhuǎn)移，使動物的某些細胞獲得外源基因，這些細胞局限于某些組織中，而其它組織細胞中則并無外源基因，因此呈雜合狀態(tài)基因敲除Knockoutmutation

–采用同源重組的方法使某個基因發(fā)生缺失或滅活，從而失去功能，通常當對受精卵進行基因敲除則產(chǎn)生的動物便因某種基因缺失，而對其生長、發(fā)育及其它代謝過程產(chǎn)生影響轉(zhuǎn)基因的物種模型Arabadopsis(plant)C.elegans(worm)FruitfliesXenopus(frog)ZebrafishMiceRatsPigsSheepGoatsCows被轉(zhuǎn)移基因的類型小分子重組DNA(SmallrecombinantDNAmolecules)–

采用基因或其cDNAs

構建適當?shù)谋磉_載體，以基因轉(zhuǎn)移技術導入宿主細胞中以獲得外源基因的表達報告基因(Reporterconstructs)——目標基因的啟動子與某些較易檢測的基因相連構建成表達盒子，采用檢測報告基因的表達來分析目標基因的啟動子的強弱及其調(diào)控，這些報告基因有GFP,lacZ,luciferase）大分子天然DNA(LargenativeDNAmolecules)酵母人工染色體(yeastartificialchromosomes,YACs)

細菌人工染色體(bacterialartificialchromosomes,BACs)青蛙是最早進行轉(zhuǎn)基因試驗的動物之一當時并非采用分離DNA的技術，而是采用核轉(zhuǎn)移技術，即現(xiàn)在采用的動物克隆技術當時建立了核的顯微注射技術轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠是最早問世的轉(zhuǎn)基因動物。1982年將生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠獲得成功，轉(zhuǎn)基因小鼠的體重是正常個體的二倍，被稱為“超級鼠”。轉(zhuǎn)基因小鼠證明了生物技術可以改變動物的天然屬性，顯示了轉(zhuǎn)基因動物的廣闊應用前景。轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生Exampleoftransgenicmouse基因靶向技術:基因敲除小鼠或突變小鼠Generationofmutant(chimeric)mousestrainelectroporatetargetingvectormicroinjectionintoblackembryoX+/+EScellshomologousrecombination+/-EScellsscreenchimeraprogeny+/++/++/-基因敲除小鼠對于發(fā)現(xiàn)有價值基因十分有益，尤其是某些自然狀態(tài)下不存在的突變株特別提示研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠通常并不受基因缺失的影響，許多基因表現(xiàn)為非依賴性，即非必需基因大多數(shù)基因表現(xiàn)為多能性，具有多種生物學功能，它們在不同的組織中，以不同的方式進行表達，尤其在發(fā)育的不同的階段的表達對于其生物學功能，從更全面的層次進行理解應用轉(zhuǎn)基因技術的研究解救突變體以轉(zhuǎn)基因鼠作為生物反應器合成人單克隆抗體合成其它有價值蛋白結構與功能關系研究人類疾病的小鼠模型分析疾病的細胞與分子機制指導治療藥物的篩選指導基因治療按受累的器官和組織系統(tǒng)列表的鼠疾病模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病–11視覺與聽覺障礙疾病–7骨、皮膚和結締組織相關疾病–16神經(jīng)和神經(jīng)肌肉障礙性疾病–22腫瘤–11免疫學和血液系統(tǒng)疾病–17激素和代謝障礙性疾病–24多因性人類疾病–6遺傳性疾病的小鼠模型舉例鐮刀狀細胞貧血(Sicklecelldisease)–采用基因敲除和轉(zhuǎn)基因建立小鼠的鐮刀狀細胞貧血，特性地將內(nèi)源性球蛋白基因缺失，造成小鼠的鐮刀狀細胞貧血肺中囊性纖維化(Cysticfibrosis)–主要采用基因敲除模型，也有少數(shù)采用轉(zhuǎn)基因多囊腎疾病治療(Polycystickidneydisease)–y主要采用基因敲除技術嗜眠癥(Narcolepsy)–基因敲除模型及思考轉(zhuǎn)基因魚1984年，朱作言等首次采用人生長激素基因(hGH)構建了轉(zhuǎn)基因金魚。目前已有鯽魚、鯉魚、泥鰍、鱒魚、大馬哈魚、鯰魚、羅非魚、魴魚等被用于轉(zhuǎn)基因研究。已有多種哺乳動物和鳥類的基因被成功地整合到魚類基因組中。轉(zhuǎn)基因魚轉(zhuǎn)基因魚的主要目的是：（1）提高魚類生長速度和抗逆性。生長激素基因(哺乳動物、鳥類、魚類)；抗凍蛋白基因（擬鰈）（2）作為發(fā)育生物學研究的模型。轉(zhuǎn)基因雞家禽受精卵從輸卵管排出需要20多個小時，產(chǎn)出時的卵已有6000多個細胞。蛋產(chǎn)出前的操作：受精后第一次卵裂前取出單細胞卵，在體外進行轉(zhuǎn)基因操作，然后用代用蛋殼作為培養(yǎng)器皿在體外培養(yǎng)至孵化。英國Perryetal采用顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因雞。精子載體法是很有前途的轉(zhuǎn)基因家禽方法。轉(zhuǎn)基因雞蛋產(chǎn)出后的操作：胚胎干細胞(ES)法和原生殖細胞(primordialgermcell,PGC)法。轉(zhuǎn)基因家禽主要以抗病性和改良生產(chǎn)性狀為目標。（抗流感病毒基因Mx1、生長激素基因）用雞蛋生產(chǎn)外源蛋白。轉(zhuǎn)基因家畜哺乳動物體外受精餓胚胎移植技術為轉(zhuǎn)基因家畜的成功提供了有效的技術手段。提高抗病性和改善生產(chǎn)性能。因為家畜與人的生物學相似性，在器官移植、藥物生產(chǎn)和特殊疾病模型等方面顯示出特殊的價值。In1997,researchersatScotland'sRoslinInstitutesparkedinternationaldebatewhentheyannouncedthecloningofasheepnamedDolly.Theeventbroughthumankindtoanothercrossroadsof