金黃色葡萄球菌檢驗與計數(shù)

概況葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個菌種，從人體上可檢出12個種。葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血動物的粘膜相關(guān)系，有些種是人及動物的條件致病菌。金黃色葡萄球菌對人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。目前一頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌的生物學特性形態(tài)與染色：金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.4～1.2μm，大小不一，平均直徑約為0.8μm。革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列。無鞭毛、無芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。目前二頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點培養(yǎng)特性：易培養(yǎng)，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好。需氧或兼性厭氧。最適生長溫度37°C，最適生長pH7.4。耐鹽性強，在含10～15%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長，可用于篩選菌種。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)18～24ｈ，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落?？僧a(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。目前三頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為β型溶血。可產(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗、VP試驗多為陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽性。目前四頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌的酶金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認為，血漿凝固陽性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無致病力的菌株。血漿凝固酶對熱穩(wěn)定，能抵抗60℃30min甚至100℃30min后，仍能保存大部分活性。耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標之一。該酶的最適pH為9.0。目前五頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本菌引起的食物中毒是因為食品污染了金黃葡萄球菌后，由細菌產(chǎn)生大量腸毒素而導致的。近年報導表明，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在實驗室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且1個菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素。腸毒素是一種可溶性蛋白質(zhì)，由單個無分枝的肽鏈組成。分子量約為3000左右。易溶于水，難溶于有機溶劑。金黃色葡萄球菌的腸毒素目前六頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點耐熱，經(jīng)100℃煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強，一般烹調(diào)溫度不能將其破壞。218~248℃的油中需30min才能被破壞?？梢鸺毙晕改c炎。根據(jù)腸毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E5個型。A型腸毒素引起的食物中毒較多，約占50%左右。其他依次為D、C、B和E型。也有A＋D、A＋B、A＋C、B＋C等。目前七頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點A型腸毒素毒力較強，攝入1μg即可引起中毒；B型毒力較弱攝入25μg，才引起中毒。一般認為引起人中毒的最小劑量是1.0~7.2μg/kg。目前八頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌檢驗目前九頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌的檢測程序檢樣25g(mL)＋225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯36±1℃Baird-Parker平板，血平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶試驗報告血平板18~24h，Baird-Parker平板18~24h或45~48h。BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面36±1℃18~24h目前十頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點增菌培養(yǎng)基7.5%氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長，除某些嗜高鹽的海洋菌外，大多數(shù)細菌都被增菌液中的高鹽所抑制。胰酪胨大豆肉湯：含氯化鈉達10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氫二鉀和葡萄糖促進葡萄球菌的生長。目前十一頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。目前十二頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點增菌與分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)：吸取5mL上述樣品勻液，接種于50mL7.5%氯化鈉肉湯或10%胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。目前十三頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點分離培養(yǎng)基Baird-Parker瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細菌的繁殖，并能促進金黃色葡萄球菌的生長使其產(chǎn)生黑色和暈圈。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進金黃色葡萄球菌的生長。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：圓形、光滑凸起、濕潤，直徑約2~3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶而可見無混濁帶和透明圈的非典型菌落。目前十四頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。目前十五頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌空白培養(yǎng)基培養(yǎng)基用途測試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標準特性反應Baird-Parker生長率金黃色葡萄球菌ATCC6538；金黃色葡萄球菌ATCC25923TSA定量PR≥0.5黑色/灰色菌落帶透明帶選擇性大腸埃希氏菌ATCC25922或8739-----定性全部抑制特異性表皮葡萄球菌ATCC12228-----定性-----黑色/灰色菌落無透明帶目前十六頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點分離培養(yǎng)基血瓊脂：是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有5%的脫纖維血(羊血或兔血)。用于觀察金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上呈β溶血。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：呈金黃色，有時也呈白色，大而突起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的β溶血環(huán)。目前十七頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌的重要鑒定-

血漿凝固酶試驗

試驗原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細菌表面，產(chǎn)生凝固。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。目前十八頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點血漿凝固酶試驗挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。目前十九頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復實驗。目前二十頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點結(jié)果報告如血漿凝固酶試驗陽性，可判定為金黃色葡萄球菌。報告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。目前二十一頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點影響血漿凝固酶試驗的因素血漿：血漿凝固酶試驗可選用人血漿或兔血漿。用人血漿出現(xiàn)凝固的時間短，約93.6%的陽性菌在1h內(nèi)出現(xiàn)凝固。用兔血漿1h內(nèi)出現(xiàn)凝固的陽性菌株僅達86%，大部分菌株可在6h內(nèi)出現(xiàn)凝固。若被檢菌為陳舊的培養(yǎng)物（超過18~24h），或生長不良，可能造成凝固酶活性低，出現(xiàn)假陰性。目前二十二頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實驗，因所有高鹽培養(yǎng)基都可以抑制A蛋白的產(chǎn)生，造成假陰性結(jié)果。不要用力振搖試管，以免凝塊振碎。實驗必需設(shè)陽性(標準金黃色葡萄球菌)、陰性(白色葡萄球菌)、空白(肉湯)對照。玻片法只能檢測結(jié)合凝固酶，而試管法可檢測兩種凝固酶。因此，兩種試驗所得結(jié)果可完全不同。玻片法只用于篩選。目前二十三頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點金黃色葡萄球菌計數(shù)

目前二十四頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點第一法BairdParker平板法第二法MPN法第三法PetrifilmTM測試片法目前二十五頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點第一法:平板計數(shù)法目前二十六頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點檢驗程序檢樣25g(mL)＋225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液10倍稀釋選擇三個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板計數(shù)及血漿酶試驗報告36±1℃45~48h目前二十七頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml，以0.3，0.3，0.4ml接種量，分別加入三塊Baird-Parker平板，用L棒涂布整個平板，(注意不要觸及平板的邊緣)。接種前應注意保持平板的干燥(可在20~50℃的培養(yǎng)箱中干燥)，通常情況下涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板置36±1℃培養(yǎng)1h后，再反轉(zhuǎn)平板，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度與時間：36℃±1℃，45~48h。典型菌落確認：從典型菌落中任選五個菌落（小于五個全選），分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h后進行血漿凝固酶試驗。目前二十八頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點典型菌落計數(shù)與計算公式的應用計數(shù)范圍要求：選擇合計菌落數(shù)在20~200的平板，計數(shù)典型菌落。目前二十九頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點公式一的使用范圍：---最低稀釋度平板的菌落小于20cfu，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；---某一稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，但上一稀釋度平板上沒有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；---某一稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，且上一稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在20cfu～200cfu之間，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；目前三十頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點公式一T=AB/CdT:樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)；A:某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B:某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；C:某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數(shù)；d:某一稀釋度。目前三十一頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點公式應用例一公式一：T=AB/CdT=65×4÷5÷0.1=520樣品稀釋度10－110－2典型菌落數(shù)66，646，6用于做血漿凝固酶菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)44高、低稀釋度平板均有典型菌落，但其中高稀釋度二平板的菌落數(shù)均不在20~200之間，選擇低稀釋度的平板進行計數(shù)。目前三十二頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點N=∑T/1.1d∑T：兩個稀釋度平板上確認的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)之和；d：稀釋因子(第一稀釋度)。公式二的使用范圍：平板菌落數(shù)均在20cfu～200cfu之間。公式引用于ISO6888-1:1999(E)公式二目前三十三頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點公式應用例二公式二：N=∑T/1.1d

T1=183×3÷5=110T2=21×4÷5=17∑T=T1+T2=110+17=127N=∑T/1.1d=127÷1.1÷0.1=1200樣品稀釋度10－110－2典型菌落數(shù)185，18020，22用于做血漿凝固酶菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)34所有稀釋度平板合計菌落數(shù)均在20~200間：目前三十四頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點結(jié)果報告單位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N為0，報告<1d-1

cfu/mL(g)。目前三十五頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點第二法MPN法目前三十六頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點MPN檢驗程序25g(mL)檢樣+225mL稀釋液，勻質(zhì)10倍系列稀釋選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸1mL樣液，每稀釋度各接種3管胰酪胨大豆肉湯，樣品的最高稀釋度，能達到獲得陰性終點36±1℃45~48h接種Baird-Parker平板血漿凝固酶試驗45~48h36±1℃查MPN表報告結(jié)果目前三十七頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點接種和培養(yǎng)根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml接種到胰酪大豆肉湯管，每稀釋度接種3管。36℃±1℃培養(yǎng)45~48h。用接種環(huán)從有細菌生長的各管中，移取1環(huán)分別接種于Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)45~48h。確認典型菌落，并從典型菌落中至少挑取1個菌落做血漿凝固酶試驗。目前三十八頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點結(jié)果報告計算血漿凝固酶試驗陽性菌落對應的管數(shù)，查MPN檢索表。結(jié)果報告：MPN/g或MPN/mL目前三十九頁\總數(shù)四十五頁\編于二十點注意要點MPN法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品?！皹悠返淖罡呦♂尪龋苓_到獲得陰性終點”的理解：--盡可能避免>1100MPN/g或ml的出現(xiàn)。