第八章抗生素藥物的分析

第八章抗生素藥物的分析第1頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)概述抗生素的概念：具有抑制或殺滅微生物的一類物質(zhì)?？股氐奶卣鳎荷矬w在生命活動過程中合成的次級代謝產(chǎn)物。性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解、聚合純度一般較低臨床上會引起不良反應(yīng)臨床應(yīng)用廣泛，影響大第2頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三抗生素藥品質(zhì)量研究的項目：性狀及鑒別試驗，含量測定或效價測定，酸堿度測定，澄明度，水分或干燥失重，安全試驗（異常毒性），熱原，降壓物質(zhì)，無菌。其他檢查：組分、雜質(zhì)、晶型、比旋度、灰分、重金屬、熔點等?？股厮幤贩治龀Ｓ玫姆椒ǎ何锢矸椒?旋光法、紫外、紅外、色譜等化學(xué)方法（專屬性不強）：功能團(tuán)反應(yīng)，鑒別和含量的測定。容量分析法：酸堿滴定（青霉素含量測定）和碘量法。生物學(xué)方法：酶反應(yīng)、微生物法測定效價第3頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)抗生素效價微生物檢定法一、微生物檢定法定義：是利用微生物發(fā)育時對某些物質(zhì)的特殊依賴性，按這些物質(zhì)對微生物生長的影響，對他們作出定量鑒定的方法。微生物檢定法可分為三類：稀釋法（dilutemethod）、比濁法（turbidcomparemethod）、瓊脂擴散法（diffusemethod）。第4頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三與化學(xué)方法相比：優(yōu)點：1、原理與醫(yī)療要求基本一致2、對微生物作用直接反映其抗菌活性缺點：1、結(jié)果是總效價，無法區(qū)分多組分2、時間長，有一定誤差，操作繁雜第5頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三二、抗生素標(biāo)準(zhǔn)效價（potency)單位牛津單位:抑制50毫升肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌生長的青霉素的最低含量為一個牛津單位.一個牛津單位相當(dāng)于0.6ug的青霉素鈉鹽所具有的抗生活力，1mg青霉素G鈉鹽含有1667個牛津單位,(IU)（一）稀釋單位(u/ml，u/mg)將1mg抗生素配成溶液，在一定條件下進(jìn)行稀釋，對某一細(xì)菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為1mg抗生素中可含有的單位。第6頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三（二）重量單位(u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作為抗生素的單位。稱重量單位.。如一個鏈霉素堿單位的重量為1微克，一個青霉素G鈉鹽的單位的重量為0.6微克。同一種抗生素的各種鹽的校價可根據(jù)其分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進(jìn)行換算而得。第7頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三青霉素G鉀鹽的理論效價（U/mg）=（U/mg）第8頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三1類似重量單位:以抗生素鹽類純品的重量為單位。包括無生物活性的酸根和金屬離子。2重量折算單位以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙嶋H重量為一個單位，3特定單位

以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一重量為一個單位，經(jīng)有關(guān)國家權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可而定.第9頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三效價測定的方法：一、稀釋法（dilutemethod）二、比濁法（turbidcomparemethod）三、瓊脂擴散法（diffusemethod）

第10頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三一、稀釋法原理：用液體培養(yǎng)基逐級將抗生素稀釋，在各管中加入等量的試驗菌液，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察抑制細(xì)菌生長的最低抗生素濃度，再與同法測定的標(biāo)準(zhǔn)品終點作比較，從而求得被測抗生素的效價。第11頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三X=(T/S)*CX樣品效價(U/ml)T檢品液最大稀釋倍數(shù)S標(biāo)準(zhǔn)品液最大稀釋倍數(shù)C標(biāo)準(zhǔn)品液效價(U/ml)第12頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三

試管編號12345678910稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品供試品2--4--8--16--32-+64++128++256++512++1024++

-：細(xì)菌被抑制+：細(xì)菌生長X=(T/S)*C=（16/32）*40=20（U/ml)第13頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三檢測終點判斷：1、試驗菌生長完全抑制2、生長50%抑制3、指示劑變色4、電位差的改變5、菌種的溶血現(xiàn)象等第14頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三二、比濁法原理：將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培養(yǎng)（約3-4h），測量培養(yǎng)基濁度，其濁度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系，在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直接受抗生素效價的影響。第15頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三影響因素：一、影響比濁法的物理因素1、散射現(xiàn)象2、菌液濃度：3、細(xì)菌體大小的變化二、培養(yǎng)基：在沒有外加抑制劑的情況下，菌體的生長受培養(yǎng)基的成分、酸度、培養(yǎng)溫度、通氣等條件影響。一般的試驗菌是金黃色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。三、培養(yǎng)：溫度、振搖。一般培養(yǎng)時間3小時，可縮短為2小時。第16頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三操作流程如圖：第17頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三基本要點：1培養(yǎng)條件的控制：試管規(guī)格均一水浴箱水溫均勻，試管按拉丁方排列。2細(xì)菌生長誤差的控制：3測量時間的控制：各管應(yīng)先充分混勻，將菌液移入比色皿后靜止2分鐘后測定。第18頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三三、瓊脂擴散法（diffusemethod）

即管碟法管碟法原理:抗生素在涂布特定菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴散，形成一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制試驗菌生長，通過透明培養(yǎng)基觀察抑菌圈，抗生素劑量的對數(shù)與抑菌圈面積或直徑成正比。在同樣條件下將已知效價的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反應(yīng)(抑菌圈)進(jìn)行比較；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液．對一定試驗菌所得的劑量反應(yīng)曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)互相平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計為一劑量法、二劑量法及三劑量法。從而可以較為準(zhǔn)確地測定供試品的效價。第19頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三抑菌圈的形成第20頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三

M:抗生素在管中的量D：擴散系數(shù)T：擴散時間C：最低抑菌濃度H：培養(yǎng)基厚度第21頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三D的影響因素：

抗生素本身結(jié)構(gòu)、分子量等，結(jié)構(gòu)簡單者容易擴散，分子量大的擴散就慢，

雜質(zhì)：抗生素或培養(yǎng)基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也有擴散系統(tǒng)，看干擾抗生素的擴散，影響抑菌圈的大小和清晰度。

瓊脂含量：含量過多影響抗生素的擴散，過少又使鋼管下陷，影響抑菌圈的大小。

菌種對抗生素的吸附作用：

pH影響分子的形式、

溫度影響擴散

D增大，r也增大

第22頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三T的影響：一般T增加，r增大，但時間太長影響抑菌圈清晰度。M的影響：在一定的范圍內(nèi)，小管內(nèi)M越大，抑菌圈直徑越大，M還與抗生素的抗菌活性、濃度、鋼管的大小、劑型、輔料等有關(guān)。C的影響：C越小，抑菌圈直徑越大，C與菌種、菌量、培養(yǎng)基、溫度等有關(guān)H的影響：培養(yǎng)基增厚，則抑菌圈減小。第23頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三操作中要注意：1試驗菌種：挑選合適的敏感菌；用適宜的菌種保存方法；定期對菌種分離純化；控制菌齡菌量。2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的成分影響抑菌圈的大小和清晰度，pH也很重要。第24頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）原理：在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑隨抗生素濃度的增減而增減。并且抑菌圈的直徑與抗生素的對數(shù)劑量成線性關(guān)系。據(jù)此測定抗生素效價。

第25頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三Y=a+bXY:抑菌圈直徑A：截距B：斜率X：抗生素濃度的對數(shù)。

第26頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三方法：為了消除平板間的差異，在每一平板的含菌培養(yǎng)基上放置6個小鋼管，相間的3個小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的某一濃度（Ck）,他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為，另外3個小管內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度（Co）,他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為。令fk=這樣采用自身對照的方法，可以消除平板間的誤差，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。f=a+bX標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：做8個濃度，取24個平皿，分8組，每組3個取平均值。fk對X作圖。-

第27頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三檢品的效價檢定：取3個平皿，每個放6個小管。在間隔的3個小管內(nèi)加入抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的中心濃度(Co),另3個小管內(nèi)加入估計濃度相當(dāng)于Co的檢品溶液。測量出fk,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出檢品的濃度，在換算出每毫克的單位數(shù)。第28頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三二劑量法：將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品及檢品各稀釋成有一定比例的二種劑量（2：1或4：1），即高劑量和低劑量，在同一平板上進(jìn)行對比，根據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈大小來計算檢品效價的方法。

第29頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第30頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三SH:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（dS2）所致的抑菌圈直徑SL：為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量(dS1)所致的抑菌圈直徑UH：為抗生素檢品高劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑UL：為抗生素檢品低劑量(dT1)所致的抑菌圈直徑

第31頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三要求：1、高劑量抑菌圈直徑應(yīng)為20~24nm，個別可為18~24mm，高劑量與低劑量抑菌圈直徑之差應(yīng)大于或等于2mm。2、底層瓊脂20ml，上層5ml，每一檢品所用平板不少于4個。3、等距安置小鋼管4個，相對角為同一物質(zhì)。4、θ為100±10%（更精確要求100±5%）5、標(biāo)準(zhǔn)品與檢品同質(zhì)第32頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三三劑量法：

應(yīng)用高、中、低三種劑量，在同一實驗條件下比較標(biāo)準(zhǔn)品及檢品溶液的抑菌圈大小，以求得檢品效價的方法。第33頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第34頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三

S3:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品高劑量（dS3）所致的抑菌圈直徑S2:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品中劑量（dS2）所致的抑菌圈直徑S1:為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品低劑量（dS1）所致的抑菌圈直徑U3：為抗生素檢品高劑量(dT3)所致的抑菌圈直徑U2：為抗生素檢品中劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑U1:為抗生素檢品低劑量(dT1)所致的抑菌圈直徑第35頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三要求：1、標(biāo)準(zhǔn)品中劑量抑菌圈直徑15~18mm2、高、中、低劑距為1:0.83、每一檢品不得少于6個平皿4、每板上等距安放小鋼管6個5、θ:100±10%（100%±5%）第36頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三三影響抗生素效價管碟法測定結(jié)果的因素及其控制（一）影響抑菌圈形狀的因素與控制1．稀釋抗生素用的緩沖液的PH值、鹽濃度的影響.pH值低或含鹽濃度高，就會不顯抑菌圈或呈卵圓形抑菌圈。這是因為抗生素溶液的鹽濃度高或pH值過低，可能改變抗生素分子的解離狀態(tài)，影響了抗生素對試驗菌抑制作用。2．制各瓊脂培養(yǎng)基菌層，加菌時培養(yǎng)基溫度的影響3．測試用的器材洗凈度的影響4雙碟培養(yǎng)溫度的影響5其他操作的影響第37頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三（二）影響抑菌圈邊緣清晰度的因素與控制1試驗菌長時間放置．菌群中的一些菌株生理特性有所變化，或是生長速度改變，或?qū)股氐拿舾卸扔兴兓?，往往出現(xiàn)雙圈，抑菌圈的邊緣不清。在檢定時菌層培養(yǎng)基中的菌量影響抑菌圈，菌層培養(yǎng)基中的菌量過低，抑菌圈邊緣模糊不清，菌量過高、使抑菌圈太小并且影響試驗菌靈敏度。因此，在正式檢測之前，找出最適菌量。2培養(yǎng)基的原材料品種與質(zhì)量，生測用培養(yǎng)基用的原材料的選擇很重要。3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值或增加適量的鹽濃度可使抑菌圈清晰.4．不適當(dāng)延長雙碟的培養(yǎng)時間，使抑菌圈邊緣不清。第38頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三抗生素效價管碟法測定的操作技術(shù)操作分為八步：1試驗菌的純化與懸液的制備2緩沖液、滅菌水與培養(yǎng)基的制備3標(biāo)準(zhǔn)品、供試品的稱量、溶解與稀釋4雙碟的制備及放管5滴加藥液6恒溫培養(yǎng)7測量抑菌圈直徑或面積8計算操作流程：第39頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第40頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三四、比濁法與管碟法比較比濁法管碟法優(yōu)點1、快速1、結(jié)果較穩(wěn)定2、客觀、精確2、大批量3、無擴散影響缺點1、對樣品潔凈度要求高1、擴散因素影響較大2、實驗要求較嚴(yán)2、時間長（2天)3、操作繁瑣,人為因素的干擾第41頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)抗生素類藥物的鑒別第42頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三一、β-內(nèi)酰胺類抗生素的鑒別結(jié)構(gòu)的共同點：1、和內(nèi)酰胺相鄰的碳原子上有一羧基，2、內(nèi)酰胺中氮原子相對的碳原子上有一功能團(tuán)氨基。

分類：青霉烷類，頭孢烯類，碳青霉烯類（硫霉素），單環(huán)β-內(nèi)酰胺（克拉維酸）。第43頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三鑒別：1、酶法：β-內(nèi)酰胺酶2、紅外吸收光譜法：3000-2800(C-H),3350cm-1(N-H),1800-1600(羰基)，1460-1375（甲基或次甲基）3、紫外吸收光譜法4、茚三酮反應(yīng)：是α氨基的反應(yīng)，與茚三酮縮合，生成藍(lán)紫色化合物。

5、色譜法：薄層色譜后，氯鉑酸與硫醚基反應(yīng)是靈敏度高的顯色試劑

第44頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三二、氨基糖苷類抗生素環(huán)己醇配基以糖苷鍵與氨基糖相連。鏈霉素，布魯霉素，卡那霉素，慶大霉素，新霉素。（一）呈色反應(yīng)1、茚三酮反應(yīng)：2、坂口反應(yīng)：鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍特有。鏈霉胍，8-羥喹啉分別與次溴酸鈉反應(yīng)，其各自的產(chǎn)物在相互作用生成橙紅色化合物。

3、糖類反應(yīng)：莫利西反應(yīng)脫水α-奈酚糖糠醛紅紫色產(chǎn)物第45頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三4、埃爾松-摩根：樣品在強酸或強堿水解后釋放出氨基乙糖，在堿性條件下與乙酰丙酮縮合，形成吡咯樣的衍生物，在堿性條件下與對二甲胺基苯甲醛的乙醇及鹽酸溶液成紅色，在540nm處可定量測定。5、麥芽酚反應(yīng)：水解、重排Fe3+鏈霉糖麥芽酚紫紅色絡(luò)合物OH-H+第46頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三三、四環(huán)類抗生素結(jié)構(gòu):氫化四駢苯,四環(huán)素，土霉素，金霉素，強力霉素。

（一）呈色反應(yīng)1、濃硫酸反應(yīng)四環(huán)素深紫色；金霉素藍(lán)色至綠色；土霉素朱紅色；強力霉素黃色；2、三氯化鐵反應(yīng)：酚羥基（二）熒光反應(yīng):土霉素綠色熒光，四環(huán)素黃色熒光

（三）紫外光譜（四）色譜第47頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三四、大環(huán)內(nèi)酯抗生素結(jié)構(gòu)：一個大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為母核，通過糖苷鍵與1-3個糖相連。（紅霉素，螺旋霉素，柱晶白霉素）（一）呈色反應(yīng)1、硫酸反應(yīng)：遇硫酸均呈紅棕色

2、莫利西反應(yīng)：糖類的反應(yīng)3、Seliwanaff反應(yīng)：脫水間苯二酚糖糖醛衍生物具顏色產(chǎn)物紅霉素淡黃色；螺旋霉素亮紫紅色；碳霉素深青紫色；柱晶白霉素淡青色；第48頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三（二）薄層色譜(三)光譜學(xué)鑒別紫外光譜紅外光譜第49頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三五、利福霉素類抗生素的鑒別結(jié)構(gòu)：一個脂肪鏈經(jīng)過酰胺鍵與一個平面的芳香基團(tuán)連接成一個環(huán)橋式化合物，所以又稱環(huán)橋類抗生素。代表藥物：利福平（rifampicin）鑒別：呈色反應(yīng)：1濃鹽酸反應(yīng)：2三氯化鐵：，向1毫升利福霉素的溶液中，滴加三氯化鐵乙醇溶液，有綠色，藍(lán)綠色。表明有酚羥基3硝酸鹽反應(yīng)：利福平，溶液中加入硝酸鈉溶液，顏色由橙色變?yōu)榘导t色。第50頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三六、多肽類抗生素：抗感染的桿菌肽（Bacitracin）、多粘菌素、萬古霉素。用于癌癥治療的放線菌蘇D、搏來霉素。鑒別：茚三酮反應(yīng)：磷鎢酸反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)：第51頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)抗生素類藥物的雜質(zhì)檢查一、高分子雜質(zhì)、降解產(chǎn)物及異構(gòu)體1、青霉素過敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白凝膠過濾法分離，用Penamaldate法測定HgCl2青霉噻唑衍生物Penamaldate半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素中微量雜質(zhì)N,N二甲基苯胺的測定：第52頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三2、鏈霉素毒性雜質(zhì):鏈霉胍,鏈胍雙氫鏈糖;雙氫鏈霉素;鏈霉素醛基結(jié)合物;神經(jīng)毒性：二鏈霉胺二鏈霉胺含量測定原理:二鏈霉胺等不被KBH4還原，能與鹽酸氨基脲反應(yīng)，生成的縮氨脲在233nm有吸收峰第53頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三3、土霉素脫水土霉素、差向土霉素、α-阿撲土霉素、β-阿撲土霉素等降解產(chǎn)物薄層分離，熒光測定4、四環(huán)素脫水四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素HPLC測定第54頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三二、無機雜質(zhì)的檢查三、溶媒殘留量1、比色法：甲醇氧化成甲醛，用品紅試劑測定丙酮與水楊醛縮合比色醋酸丁酯與鹽酸羥胺反應(yīng)后比色測定2、氣相色譜3、HPLC4、紅外光譜第55頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三青霉素鈉

拼音名：Qingmeisuna英文名：BenzylpenicillinSodiumC16H17N2NaO4S356.38

本品為(2S,5R,6R)-3,3-二甲基-6-(2-苯乙酰氨基)-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-2-甲酸鈉鹽。按無水物計算，含青霉素按C16H17N2NaO4S計算，不得少于96.0％

【性狀】

本品為白色結(jié)晶性粉末；無臭或微有特異性臭；有引濕性；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效，水溶液在室溫放置易失效。

本品在水中極易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液狀石蠟中不溶。

第56頁，共58頁，2023年，2月20日，星期三【鑒別】(1)取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml,在37℃滅活1小時后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。

(2)取本品約0.1g，加水5ml溶解后，加稀鹽酸2滴，即生成白色沉淀；此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或過量的鹽酸中溶解。