食品衛(wèi)生微生物指標(biāo)的檢測新

食品衛(wèi)生微生物指標(biāo)的檢測新第1頁/共220頁

根據(jù)食品衛(wèi)生要求,食品中需要檢測的微生物種類、數(shù)量及其代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量稱為食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標(biāo)，是評(píng)判食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要依據(jù)。1、什么叫食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標(biāo)?2、食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標(biāo)的種類：菌落總數(shù)；大腸菌群數(shù)；致病菌；霉菌及其毒素；其他指標(biāo)。

我國衛(wèi)生部頒布的食品衛(wèi)生微生物學(xué)指標(biāo)主要有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。第2頁/共220頁指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）培養(yǎng)后，單位重量(g)、容積(ml)或表面積(cm2)食品檢樣所產(chǎn)生的細(xì)菌菌落形成單位數(shù)(colonyformingunits,CFU)。⑴菌落總數(shù)totalcolonynumber細(xì)菌總數(shù)(totalbacterianumber)是死的、活的細(xì)胞的總數(shù)。第3頁/共220頁⑵大腸菌群

大腸菌群系指一群在37℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽胞桿菌。coliformgroup

我國和許多國家均采用相當(dāng)于100ml(g)食品檢樣中大腸菌群的最大可能數(shù)（mostprobablenumber,MPN）來表示。第4頁/共220頁⑶致病菌

致病菌即能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌。

對(duì)不同的食品和不同的場合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn):海產(chǎn)品以副溶血性弧菌作為參考菌群蛋與蛋制品以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌等作為參考菌群米、面類食品以蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌、霉菌等作為參考菌群罐頭食品以耐熱性芽孢菌作為參考菌群等等第5頁/共220頁⑷霉菌及其毒素

我國還沒有制定出霉菌的具體指標(biāo)，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對(duì)產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn)。例如：曲霉屬的黃曲霉、寄生曲霉等，青霉屬的桔青霉、島青霉等，鐮刀霉屬的串珠鐮刀霉，禾谷鐮刀霉等等。第6頁/共220頁第7頁/共220頁第8頁/共220頁食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)菌落總數(shù)的流程圖無菌取樣樣品均質(zhì)樣品接種恒溫培養(yǎng)結(jié)果觀察樣液稀釋第9頁/共220頁第10頁/共220頁本章教學(xué)目標(biāo)

了解菌落總數(shù)的含義和測定意義，掌握菌落總數(shù)測定的方法；了解大腸菌群的含義和測定意義，掌握大腸菌群的檢測方法；了解食品中幾種常見致病的檢測方法及其原理。

本章教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：菌落總數(shù)、大腸菌群的含義及測定方法；食品中常見致病菌種類的生物學(xué)特性及檢驗(yàn)方法。難點(diǎn)：菌落總數(shù)測定的計(jì)數(shù)和報(bào)告；如何根據(jù)大腸菌群的生物學(xué)特性及試驗(yàn)結(jié)果判別大腸菌群的真假。食品中常見致病菌的檢測方法及其原理。第11頁/共220頁3.1食品中菌落總數(shù)的測定

3.2食品中大腸菌群的檢測3.3食品中常見的致病菌的檢測第三章目錄第12頁/共220頁3.1.1菌落總數(shù)的概念及測定意義3.1.2菌落總數(shù)的常規(guī)檢測方法3.1.3菌落總數(shù)的其它檢測方法3.1食品中菌落總數(shù)的測定第13頁/共220頁3.1.1菌落總數(shù)的概念及測定意義指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）培養(yǎng)后，單位重量(g)、容積(ml)或表面積(cm2)中所產(chǎn)生的細(xì)菌菌落形成單位數(shù)(colonyformingunits,CFU)。3.1.1.1菌落總數(shù)的概念第14頁/共220頁菌落計(jì)數(shù)法

方法：定量樣品經(jīng)稀釋后接種于固體培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落數(shù)檢測樣品中活菌含量。原理：一個(gè)活菌體在固體培養(yǎng)基上經(jīng)過生長繁殖可以形成一個(gè)菌落菌落計(jì)數(shù)法不能檢測出樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)第15頁/共220頁常見菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法螺旋接種法疏水網(wǎng)膜濾器法Hungate滾管計(jì)數(shù)法紙片法第16頁/共220頁3.1.1.2菌落總數(shù)的測定意義可以判定食品被細(xì)菌污染的程度觀察細(xì)菌在食品中的繁殖動(dòng)態(tài)及時(shí)反映食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求從而對(duì)被檢食品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。

通常認(rèn)為，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。通過測定菌落總數(shù)第17頁/共220頁3.1.2菌落總數(shù)的常規(guī)檢測方法(GB4789.2—2010)5.1.2.1檢驗(yàn)前準(zhǔn)備5.1.2.2檢驗(yàn)程序5.1.2.3檢驗(yàn)方法及步驟第18頁/共220頁3.1.2.1檢驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備和材料：電熱恒溫培養(yǎng)箱（36±1℃）、冰箱（0～4℃）、恒溫水浴鍋（46±1℃）、天平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、無菌刀或剪刀、無菌鑷子、75%酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄培養(yǎng)基和試劑：75%乙醇、無菌生理鹽水、15%氫氧化鈉溶液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基第19頁/共220頁無菌室滅菌融化培養(yǎng)基并置于恒溫水浴鍋（46±1℃）內(nèi)保溫標(biāo)記培養(yǎng)皿及稀釋劑試管10-110-210-310-510-4培養(yǎng)基名稱檢樣稀釋度檢測者姓名檢測日期3.1.2.1檢驗(yàn)前準(zhǔn)備第20頁/共220頁3.1.2.2檢驗(yàn)程序檢樣做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液選擇2-3個(gè)適宜稀釋度各以1ml之量分別加入無菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入46±1℃適量營養(yǎng)瓊脂菌落計(jì)數(shù)報(bào)告恒溫培養(yǎng)第21頁/共220頁3.1.2.3檢驗(yàn)方法及步驟檢樣稀釋(2)接種

(3)培養(yǎng)(4)菌落計(jì)數(shù)(5)報(bào)告第22頁/共220頁檢樣稀釋

準(zhǔn)確稱取25g(mL)樣品，經(jīng)適當(dāng)處理后，用10倍遞增稀釋法做成幾個(gè)倍數(shù)適宜的稀釋液。9ml無菌稀釋劑25g（ml）樣品225ml無菌稀釋劑1/1079ml無菌稀釋劑無菌操作第23頁/共220頁以無菌操作，將檢樣25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml無生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。另取1ml的滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。具體操作步驟第24頁/共220頁檢樣稀釋的注意事項(xiàng)各步驟一定要嚴(yán)格的做到無菌操作。為減少樣品稀釋倍數(shù)的誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖均勻，同時(shí)每遞增稀釋一次，必須更換一支吸管。第25頁/共220頁吸管尖端不能伸入無菌水，以防吸管尖端外部粘附的檢樣勻液也混入其中，影響稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的稀釋劑一般是無菌生理鹽水或無菌蒸餾水，有時(shí)采用磷酸緩沖液或0.1％的蛋白胨水，后者對(duì)已受傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋時(shí)宜采用無菌蒸餾水。檢樣稀釋的注意事項(xiàng)第26頁/共220頁(2)接種方法梗概：根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)悠肺廴厩闆r的估計(jì)，選擇2～3個(gè)稀釋度的稀釋液，用傾注法或涂布法進(jìn)行平板接種，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行試驗(yàn)。

實(shí)際操作中，檢樣稀釋和接種交叉進(jìn)行更為合理，可使操作步驟更簡便，并降低受污染的機(jī)率。第27頁/共220頁檢樣稀釋液的移?。焊鶕?jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，以同一支吸管移取1ml稀釋液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。倒平板：稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46±1℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿15ml-20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻，同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋劑（不含樣品）的無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。傾注法接種具體操作步驟第28頁/共220頁9ml無菌稀釋劑25g（ml）樣品225ml無菌稀釋劑1/1079ml無菌稀釋劑①②③④⑤⑥⑧⑦⑨⑩2×1ml1ml1ml轉(zhuǎn)動(dòng)混勻倒平板移取樣液傾注法操作流程圖第29頁/共220頁25g（ml）樣品225ml無菌稀釋劑9ml無菌稀釋劑1/107⑦⑩0.2ml0.2ml0.2ml①②③④⑤⑥⑧⑨11122×倒平板涂布法操作流程圖第30頁/共220頁移取檢樣勻液時(shí)，吸管尖端不能觸及任何物品，以免污染。以傾注法接種時(shí)，倒平板的培養(yǎng)基必須冷卻至46℃時(shí)使用，過熱會(huì)殺死細(xì)菌，過冷則不能使樣品稀釋液與其混勻。為防止細(xì)菌數(shù)量在試驗(yàn)期間發(fā)生變化，應(yīng)盡量縮短稀釋和接種的時(shí)間，一般不宜超過20min。要做空白對(duì)照平板，以便于判斷試驗(yàn)結(jié)果是否可靠，并有利于區(qū)別菌落和平板中的異物顆粒。接種的注意事項(xiàng)第31頁/共220頁(3)培養(yǎng)培養(yǎng)溫度根據(jù)食品種類而定：水產(chǎn)品多采用30℃，其它食品等均在37℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間均為48±2h培養(yǎng)時(shí)將平板翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，可以避免菌落蔓延生長?！獙⒔臃N后的冷凝平板在適當(dāng)溫度下恒溫培養(yǎng)，使平板上形成菌落的檢測過程。第32頁/共220頁(4)菌落計(jì)數(shù)——培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)及相應(yīng)的樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出食品檢樣菌落總數(shù)的過程。用肉眼（必要時(shí)用放大鏡檢查）或菌落計(jì)數(shù)器對(duì)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄根據(jù)記錄求出同一稀釋度兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)以平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，其乘積就是被檢樣品的菌落總數(shù)。一、具體操作步驟第33頁/共220頁培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。選取菌落數(shù)在30～300之間的平板計(jì)算菌落總數(shù)。低于30的平板記錄具體菌落數(shù)，高于300的則記錄為多不可記。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，應(yīng)以無片狀菌落的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。如片狀菌落不到平板的一半，則另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。二、菌落計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)第34頁/共220頁當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界限鏈狀生長時(shí)，則將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)算。不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比(同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近)，即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)(有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等)，不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。二、菌落計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)第35頁/共220頁三、菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)的范圍，則以平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為被檢樣品的菌落總數(shù)。若有二個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)均在適宜計(jì)數(shù)的范圍，則按以下公式計(jì)算：N＝∑c/(n1＋0.1n2)dN：樣品中菌落數(shù)∑c：二個(gè)稀釋度所有平板上菌落數(shù)之和n1：第一稀釋度平板個(gè)數(shù)n2：第二稀釋度平板個(gè)數(shù)d：稀釋因子（第一稀釋度）第36頁/共220頁稀釋度1∶1001∶1000平板上菌落數(shù)232，24433，35示例：N＝∑c/(n1＋0.1n2)d＝(232＋244＋33＋35)/(2＋0.1×2)×10-2＝544/0.022＝2472703版：（應(yīng)以二者比值決定，比值≤2取平均數(shù)，比值＞2則取其較小數(shù)字。）第37頁/共220頁若所有稀釋度均＞300時(shí)以最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；若所有稀釋度均＜30時(shí)以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如均不在30～300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按＜1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。三、菌落總數(shù)的計(jì)算方法第38頁/共220頁(5)報(bào)告

菌落數(shù)＜100時(shí)，按四舍五入原則修約，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)＞或＝100時(shí)，第三位數(shù)字采用四舍五入原則修約后取前兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)。也可用10的指數(shù)形式表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。固體檢樣以克(g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升(mL)為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米(cm2)為單位報(bào)告。若所有平板上菌落接蔓延生長，則報(bào)告為菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長，則檢測結(jié)果無效。結(jié)果報(bào)告單位：cfu/g(ml)第39頁/共220頁稀釋度選擇及菌落總數(shù)報(bào)告實(shí)例7000—＜1×10＜10cfu/g(ml)cfu/g(ml)菌落總數(shù)報(bào)告方式第40頁/共220頁5.1.3菌落總數(shù)的其它檢測方法紙片法螺旋接種法疏水網(wǎng)膜濾器法Hungate滾管計(jì)數(shù)法第41頁/共220頁第42頁/共220頁螺旋接種儀

基本原理：接種針將樣品液以阿基米得螺旋方式，從平板中央往外連續(xù)稀釋接種。每次接種量約0.05ml，接種于平板中央部分的菌體密度較高，往外則逐漸稀釋。培養(yǎng)后，因平板上每一特定面積的接種量為已知，所以由此部位出現(xiàn)的菌落數(shù)可以估計(jì)出原來樣品每克(或每毫升)的含菌量。螺旋接種法(SpiralPlatingMethod)第43頁/共220頁螺旋接種原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品以指數(shù)比例遞減的方式稀釋阿基米德式螺旋抽水機(jī)第44頁/共220頁①可測定500－500，000CFU/ml的菌數(shù)；②樣品不需事先稀釋；③不需作二重復(fù)；④接種速度快，每次接種只需1－2分鐘；⑤培養(yǎng)結(jié)果既可人工計(jì)數(shù)，也可用激光計(jì)數(shù)器(LaserBacteriaColonyCounter)計(jì)數(shù)；⑥人力與物力的花費(fèi)成本低廉(不考慮儀器投資成本)；⑦測定結(jié)果與傳統(tǒng)方法比較，相關(guān)性高。螺旋接種法也有一些缺點(diǎn)：①設(shè)備投資較高；②含顆粒的樣品容易堵塞接種針的微細(xì)孔道(固體樣品均質(zhì)后常有的現(xiàn)象)；③如果每ml樣品的帶菌量小于數(shù)百個(gè)或大于105個(gè)，結(jié)果的準(zhǔn)確性將降低；④對(duì)瓊脂平板的表面品質(zhì)要求較高，應(yīng)平整、無皺縮和無氣泡，否則會(huì)影響接種和計(jì)數(shù)結(jié)果。螺旋接種法的優(yōu)點(diǎn)第45頁/共220頁3.2.1大腸菌群的概念

大腸菌群系指一群好氧及兼性厭氧，在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。在微生物分類學(xué)上大腸菌群細(xì)菌主要屬于大腸艾希氏菌屬（俗稱大腸桿菌屬）、弗氏檸檬酸桿菌屬、肺炎克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬等。3.2食品中大腸菌群的檢測第46頁/共220頁靛基質(zhì)甲基紅V-P枸椽酸鹽H2S明膠動(dòng)力44.5℃乳糖大腸艾希氏菌Ⅰ大腸艾希氏菌Ⅱ大腸艾希氏菌Ⅲ＋－＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－＋/－＋/－＋/－＋－－弗氏檸檬酸桿菌Ⅰ弗氏檸檬酸桿菌Ⅱ－＋＋＋－－＋＋＋/－＋/－－－＋/－＋/－－－肺炎克雷伯氏菌Ⅰ肺炎克雷伯氏菌Ⅱ－＋－－＋＋＋＋－－－－－－－－陰溝腸桿菌＋－＋＋－＋/－＋－大腸菌群生化特性分類表第47頁/共220頁3.2.2大腸菌群的測定意義大腸菌群的食品衛(wèi)生意義：作為糞便污染食品的指標(biāo)菌。作為腸道致病菌污染食品的指標(biāo)菌。

在食品中存在的大腸菌群數(shù)量越多，表示該食品受糞便污染的程度越大，也相應(yīng)地表示該食品被腸道致病菌污染的可能性越大。第48頁/共220頁3.2.3食品中大腸菌群數(shù)量的表示方法1）大腸菌群MPN大腸菌群MPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理所測定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值；2）大腸菌群值大腸菌群值是指在食品中檢出一個(gè)大腸菌群細(xì)菌時(shí)所需要的最少樣品量。過去我國和許多國家均采用相當(dāng)于l00g(ml)食品檢樣中大腸菌群的最大可能數(shù)(MPN)來表示食品中大腸菌群的數(shù)量。

2010頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)方法以每g(ml)食品檢樣中大腸菌群的最大可能數(shù)(MPN)來表示食品中大腸菌群的數(shù)量第49頁/共220頁食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Enumerationofcoliforms2010-03-26發(fā)布2010-06-01實(shí)施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布3.2.4

食品中大腸菌群的檢測方法第50頁/共220頁GB4789.3—2010前言本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.3-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.3-2008相比，主要修改如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——“第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法”的平板菌落數(shù)的選擇范圍修改為“15CFU～150CFU”；——?jiǎng)h除了“第三法大腸菌群PetrifilmTM測試片法”。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——GB4789.3-1984、GB4789.3-1994、GB/T4789.3-2003、GB/T4789.3-2008。第51頁/共220頁食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群（Coliforms）計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2術(shù)語和定義2.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2.2最大可能數(shù)法（TheMostProbableNumberMethod、MPN法），基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。第52頁/共220頁

最大可能數(shù)(mostprobablenumber，MPN)計(jì)數(shù)又稱稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)，適用于測定在一個(gè)混雜的微生物群落中雖不占優(yōu)勢，但卻具有特殊生理功能的類群。其特點(diǎn)是利用待測微生物的特殊生理功能的選擇性來擺脫其他微生物類群的干擾，并通過該生理功能的表現(xiàn)來判斷該類群微生物的存在和豐度。TheMostProbableNumberMethod方法特點(diǎn):第53頁/共220頁3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒溫水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3.11菌落計(jì)數(shù)器。除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3設(shè)備和材料第54頁/共220頁4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。4.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。4.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。4.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。4.5無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。4.6無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。4.7無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。4培養(yǎng)基和試劑第55頁/共220頁附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第56頁/共220頁A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第57頁/共220頁第一法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法第58頁/共220頁1.1樣品的稀釋1.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。1.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.1.3樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。1操作步驟第59頁/共220頁天津“四方牌”JZ－II型均質(zhì)器煙臺(tái)先科儀器有限公司漯河市金田試驗(yàn)設(shè)備研究所瑞士固態(tài)樣品的處理第60頁/共220頁拍擊式樣品均質(zhì)器第61頁/共220頁液態(tài)樣品的處理振搖30分25（ml）樣品第62頁/共220頁1.1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.1.5根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。1操作步驟第63頁/共220頁1.2初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）。36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。1操作步驟第64頁/共220頁初發(fā)酵試驗(yàn)操作圖示10-110-2100（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h1ml1ml1ml第65頁/共220頁1.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。1.4大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告

按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。1操作步驟第66頁/共220頁復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)操作圖示（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h第67頁/共220頁被證實(shí)的初發(fā)酵試驗(yàn)中陽性管數(shù)的組合數(shù)10-110-2100（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h1ml1ml1ml（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h200大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法的全過程及結(jié)果判斷第68頁/共220頁陽性管數(shù)MPN（每ml或每g）95%可信限陽性管數(shù)95%可信限

0.100.010.001下限上限

0.100.010.001MPN（每ml或每g）下限上限

000<3.0--9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.6383104391801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.64231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901,000202204.542330240421,000210153.742331460902,000211204.54233211001804,100212278.794333>1100420--

附錄B（規(guī)范性附錄）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表第69頁/共220頁

根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每ml（g）食品中大腸菌群的MPN值。例如：大腸菌群MPN／ml(g)＝10。MPN檢索表中的可信限包含了MPN測定法的全部統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，它的精確的定義是：如果所判定的真正的菌數(shù)是在此限度內(nèi)的話，這種判定有95％是正確的。第70頁/共220頁注1：本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個(gè)稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。注3：在MPN檢索表第一欄陽性管數(shù)下面列出的mL(g)，系指原樣品(包括液體和固體)的mL(g)數(shù)，并非樣品稀釋后的mL(g)數(shù)，對(duì)固體樣品更應(yīng)注意。如固體樣品1g經(jīng)10倍稀釋后，雖加入lmL量，但實(shí)際其中只含有0.1g樣品，故應(yīng)按0.1g計(jì)，不應(yīng)按lmL計(jì)。注4：在進(jìn)行食品衛(wèi)生監(jiān)測時(shí)，對(duì)大腸菌群稀釋度的選擇如11.1mL(g)、1.11mL(g)、0.111mL(g)主要應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求。一般來說，對(duì)于大多數(shù)食品均可采用1.11mL(g)，個(gè)別食品例外，如食品包裝用紙和有的冷飲食品，由于大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)分別為3和6，故應(yīng)采用11.1mL(g)，而不能采用1.11mL(g)。第71頁/共220頁第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù)法第72頁/共220頁1操作步驟1.1樣品的稀釋按第一法進(jìn)行。1.2平板計(jì)數(shù)1.2.1選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對(duì)照。1.2.2及時(shí)將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。第73頁/共220頁A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽5g或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過3h。第74頁/共220頁Containscrystalviolet&bilesaltstoinhibitGram+bacteria,lactose&apHindicator(neutralred)todetermineabilitytofermentlactoseUninoculatedPlateVRBAneutralred:pH紅6.8-8.0黃橙第75頁/共220頁LACTOSEFERMENTERS:RED/PINKCOLONIE

Escherichiacoli；Enterobactercloacae；Klebsiellapneumoniae第76頁/共220頁NON-LACTOSEFERMENTERS:COLOURLESSCOLONIES

Salmonellatyphi:Shigellasonnei:Proteusvulgaris第77頁/共220頁1.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。1.4證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。1操作步驟第78頁/共220頁1.5大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以1.3中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。1操作步驟第79頁/共220頁附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第80頁/共220頁A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第81頁/共220頁A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)節(jié)pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過3h。第82頁/共220頁A.4磷酸鹽緩沖液A.4.1成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2A.4.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。第83頁/共220頁A.5無菌生理鹽水A.5.1成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mLA.5.2制法稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。A.61mol/LNaOHA.6.1成分NaOH40.0g蒸餾水1000mLA.6.2制法稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。第84頁/共220頁A.71mol/LHClA.7.1成分HCl90mL蒸餾水1000mLA.7.2制法移取濃鹽酸90mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，121℃高壓滅菌15min。第85頁/共220頁第86頁/共220頁3.3食品中常見的致病菌的檢測3.3.1金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)3.3.2沙門氏菌檢驗(yàn)第87頁/共220頁(staphylococcusaureus)3.3.1.1生物學(xué)特性3.3.1.2金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法3.3.1金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)第88頁/共220頁3.3.1.1生物學(xué)特性典型者球形，直徑0.5μm～1μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜。革蘭氏染色陽性。(1)個(gè)體形態(tài)第89頁/共220頁需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適生長pH7.4。普通平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板和Baird-Parker平板上形成形態(tài)特殊的菌落。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長。(2)培養(yǎng)特性Staphylococcusaureusonsaltgradientplate第90頁/共220頁

(3)生化特性

可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。第91頁/共220頁(4)抗原結(jié)構(gòu)多糖抗原：蛋白抗原：細(xì)胞壁表面的葡萄球菌A蛋白磷壁酸夾膜多糖

金黃色葡萄球菌水解，獲得兩種抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。第92頁/共220頁(5)毒素與酶

金黃色葡萄球菌的致病力主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，是膜損傷毒素?？扇芙饧t血球，在血平板上引起菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)。

殺白細(xì)胞素：可溶解白血球。血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。血漿凝固酶陽性的葡萄球菌均為金黃色葡萄球菌。因此，凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的標(biāo)志。第93頁/共220頁d.脫氧核糖核酸酶：金的脫氧核糖核酸酶耐受高溫，可作為鑒定金黃色葡萄球菌的依據(jù)；e.腸毒素：蛋白質(zhì)性質(zhì),引起急性胃腸炎，分為A、B、C、D、E及F五種血清型。

腸毒素形成條件：存放溫度，在37℃內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時(shí)間越短；存放地點(diǎn)，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素；食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時(shí)含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。腸毒素可耐受100℃煮沸30分鐘而不被破壞。此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶纖維蛋白酶、卵磷脂酶、脂肪酶等。(5)毒素與酶第94頁/共220頁3.3.1.2金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10—2010第95頁/共220頁食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Staphylococcusaureus2010-03-26發(fā)布2010-06-01實(shí)施中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布第96頁/共220頁GB4789.10—2010本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB/T4789.37-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.10-2008和GB/T4789.37-2008相比，主要修改如下：——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；——修改了范圍；——規(guī)范了樣品制備過程；——增加了計(jì)算公式中系數(shù)1.1的解釋；前言第97頁/共220頁——修改了附錄A中胰酪胨大豆肉湯的名稱，規(guī)范為10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯；——增加了第二法金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板計(jì)數(shù)和第三法金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C是規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：——GB4789.10-84、GB4789.10-1994、GB/T4789.10-2003、GB/T4789.10-2008。——GB/T4789.37-2008。前言GB4789.10—2010第98頁/共220頁食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)；第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。GB4789.10—2010第99頁/共220頁除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2℃～5℃。2.3恒溫水浴箱：37℃～65℃。2.4天平：感量0.1g。2.5均質(zhì)器。2.6振蕩器。2.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.8無菌錐形瓶：容量100mL、500mL。2.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.10注射器：0.5mL。2.11pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。2設(shè)備和材料GB4789.10—2010第100頁/共220頁3.110%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：見附錄A中A.1。3.27.5%氯化鈉肉湯：見附錄A中A.2。3.3血瓊脂平板：見附錄A中A.3。3.4Baird-Parker瓊脂平板：見附錄A中A.4。3.5腦心浸出液肉湯(BHI)：見附錄A中A.5。3.6兔血漿：見附錄A中A.6。3.7稀釋液：磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.7。3.8營養(yǎng)瓊脂小斜面：見附錄A中A.8。3.9革蘭氏染色液：見附錄A中A.9。3.10無菌生理鹽水：見附錄A中A.10。3培養(yǎng)基和試劑GB4789.10—2010第101頁/共220頁第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)GB4789.10—2010圖1金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序檢樣25g(mL)樣品+225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，均質(zhì)Baird-Parker平板,血平板BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面血漿凝固酶試驗(yàn)涂片染色觀察溶血報(bào)告36℃±1℃18h～24h36℃±1℃血平板18h～24hBaird-Parker平板18h～24h或45h～48h36℃±1℃18h～24h第102頁/共220頁1樣品的處理稱取25g樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。1操作步驟GB4789.10—2010第103頁/共220頁1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉75g蒸餾水1000mLpH7.42制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。7.5%氯化鈉肉湯GB4789.10—2010第104頁/共220頁1成分胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化鈉

100.0g磷酸氫二鉀2.5g丙酮酸鈉

10.0g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.3±0.22制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，每瓶225mL，121℃高壓滅菌15min。10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯GB4789.10—2010第105頁/共220頁225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯液態(tài)樣品的處理36±1℃18-24h25（ml）樣品第106頁/共220頁2增菌和分離培養(yǎng)2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴(yán)重時(shí)在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。2.2將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。GB4789.10—2010第107頁/共220頁1成分

豆粉瓊脂pH7.4～7.6

100mL

脫纖維羊血(或兔血)

5～10mL2制法

加熱溶化瓊脂，冷至50℃，以無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。血瓊脂平板GB4789.10—2010豆粉瓊脂成分:牛心消化湯(PH7.4～7.6)

1000mL黃豆粉浸液50mL瓊脂20g第108頁/共220頁Baird－Parker瓊脂平板

1成分

胰蛋白胨10g

牛肉膏5g

酵母膏1g

丙酮酸鈉

10g

甘氨酸

12g

氯化鋰(LiCl·6H2O)

5g

瓊脂20g

蒸餾水950mL

PH7.0±0.22增菌劑的配法：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞蹄酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。3制法

將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。

使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過48h。

GB4789.10—2010第109頁/共220頁選擇鑒別原理甘氨酸降低基質(zhì)水活度，提高滲透壓。氯化鋰抑制除假單胞菌以外的革蘭氏陰性菌還抑制鏈球菌、腸球菌。丙酮酸鈉降低基質(zhì)的氧化還原電位，有利于兼性厭氧菌的生長；并可吸收培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的H2O2，避免其傷害活力差的金黃色葡萄球菌；作為生長因子促進(jìn)生長。亞碲酸鉀的強(qiáng)氧化性使其具備抑菌作用，還原成黑色的碲酸鉀后毒性喪失，金黃色葡萄球菌能還原亞碲酸鉀。卵黃用于鑒別金黃色葡萄球菌分解蛋白、磷脂和脂肪的能力，卵黃中的不溶性磷脂蛋白被分解脫脂后使菌落周圍出現(xiàn)透明圈，磷脂被分解成磷酸膽堿等水溶性物質(zhì)和非水溶性的甘油二酯，脂肪酶可水解甘油二酯成水溶性的甘油和脂肪酸，脂肪酸遇鈣、鎂等離子發(fā)生沉淀，使菌落周圍出現(xiàn)白色渾濁帶。第110頁/共220頁2.3金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。GB4789.10—2010第111頁/共220頁Notebetahemolysis(completelysisoftheredbloodcellsaroundthecolonies;seearrows)onthebloodagarandtheorganismissensitivetotheantibioticnovobiocinintheTaxoNB?disc.StaphylococcusaureusGrowingonBloodAgar(IndirectLighting)血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。第112頁/共220頁GrowthonBloodAgarPatternsofhaemolysisS.aureus(b);S.epidermidis(no);S.saprophyticus(no)

第113頁/共220頁菌落圓形突起、光滑、濕潤，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。StaphylococcusaureusGrowingonBaird-Parker

Agar第114頁/共220頁3鑒定3.1染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。Gram-positiveStaphylococcusaureus

GB4789.10—2010第115頁/共220頁3.2血漿凝固酶試驗(yàn)：挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗(yàn)。GB4789.10—2010第116頁/共220頁1成分胰蛋白質(zhì)胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉（12H2O）2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500mLpH7.4±0.22制法加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝16mm×160mm試管，每管5mL置121℃，15min滅菌。腦心浸出液肉湯(BHI)GB4789.10—2010BrainHeartInfusionBroth第117頁/共220頁取檸檬酸鈉3.8g，加蒸餾水100mL，溶解后過濾，裝瓶，121℃高壓滅菌15min。兔血漿制備：取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置(或以3000r/min離心30min)，使血液細(xì)胞下降，即可得血漿。兔血漿GB4789.10—2010第118頁/共220頁血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果圖示1.NegativeCoagulaseTestStaphylococcusepidermidis

2.PositiveCoagulaseTestStaphylococcusaureus

Staphylococcussaprophyticus第119頁/共220頁4葡萄球菌腸毒素的檢驗(yàn)可疑食物中毒樣品或產(chǎn)生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應(yīng)按附錄B檢測葡萄球菌腸毒素。5結(jié)果與報(bào)告5.1結(jié)果判定：符合5.2.3、5.3，可判定為金黃色葡萄球菌。5.2結(jié)果報(bào)告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。GB4789.10—2010第120頁/共220頁增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)鑒定金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)主要操作步驟圖示：36±1℃18-24h25（ml）樣品革氏染色血漿凝固酶試驗(yàn)報(bào)告Baird－Parker平板血平板第121頁/共220頁第二法金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板計(jì)數(shù)GB4789.10—2010檢樣25g(mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板報(bào)告計(jì)數(shù)及血漿凝固酶試驗(yàn)36℃±1℃45h～48h圖2金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板法檢驗(yàn)程序第122頁/共220頁GB4789.10—2010作步驟1樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。第123頁/共220頁1成分：磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.22制法：貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。磷酸鹽緩沖液第124頁/共220頁1成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mL2制法稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。無菌生理鹽水第125頁/共220頁GB4789.10—20101.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.4按1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。第126頁/共220頁GB4789.10—20102樣品的接種根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。第127頁/共220頁GB4789.10—20103培養(yǎng)3.1在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)，45h～48h。第128頁/共220頁GB4789.10—20104典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)4.1金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。第129頁/共220頁GB4789.10—20104.2選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20CFU～200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果：a）只有一個(gè)稀釋度平板的菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）最低稀釋度平板的菌落數(shù)小于20CFU且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；第130頁/共220頁GB4789.10—2010c）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；d）某一稀釋度平板的菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數(shù)不在20CFU～200CFU之間，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；以上按公式（1）計(jì)算。第131頁/共220頁GB4789.10—2010e）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間，按公式（2）計(jì)算。4.3從典型菌落中任選5個(gè)菌落（小于5個(gè)全選），分別按第一法做血漿凝固酶試驗(yàn)。第132頁/共220頁GB4789.10—20105結(jié)果計(jì)算：公式（1）：T=AB/Cd式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B——某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；C——某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；d——稀釋因子。第133頁/共220頁公式（2）：T=(A1B1/C1+A2B2/C2)/1.1d式中：T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；GB4789.10—2010第134頁/共220頁B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）血漿