病毒的增殖詳解

病毒的增殖目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點§2病毒的增殖過程

動物病毒的增殖過程大致分為5個主要階段:

吸附侵入脫殼病毒成分的合成裝配與釋放目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點一、吸附

病毒與細胞表面特異性受體發(fā)生碰撞，病毒附著于細胞受體而引起的病毒感染的第一階段。目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點病毒吸附分兩步進行：可逆吸附：病毒與細胞以靜電引力相結(jié)合，是一種非特異性的吸附。與細胞和病毒的濃度成正比；也與溶液中的Ca2+、Mg2+、和Na+等離子有關(guān)（促進或抑制作用）；單純的稀釋或沖洗以及應(yīng)用抗病毒血清或高濃度的鹽類和一定的pH環(huán)境都可使病毒重新解脫。解脫的病毒具備感染性。

目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點不可逆吸附：病毒蛋白（吸附蛋白）與細胞膜表面特定蛋白（細胞受體）的特異性結(jié)合。

并非所有的病毒都有這2個階段。

通過外力作用使病毒解吸，病毒不再具備感染性。細胞表面的特定受體決定了細胞對病毒的易感性不同病毒完成吸附所需時間不一樣，但大多數(shù)病毒可以在1h之內(nèi)完成吸附過程目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點二、侵入病毒不可逆地吸附于細胞受體后，病毒以核酸或核衣殼或病毒顆粒等形式進入細胞的過程。

目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點（一）噬菌體1．無囊膜噬菌體利用尾部的溶菌酶部分破壞細菌細胞壁，尾管刺入細胞，將病毒核酸注入細胞，衣殼留在細胞外2．有囊膜的噬菌體機理仍不清楚目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點（二）植物病毒其侵入細胞的方式主要有三種：1．由攜帶有病毒的介體（主要是具有吸口器的昆蟲）在植物上取食，或以其它方式將病毒帶入細胞；2．通過自然或人為的原因造成的植物細胞壁上的傷口進入細胞：大多數(shù)實驗室采用的感染方式。3．通過植物細胞與外界環(huán)境溝通的胞外連絲和溝通兩個相鄰細胞的原生質(zhì)體的胞間連絲進入細胞目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點（三）動物病毒1、細胞吞飲病毒：e.g多瘤病毒2、病毒直接轉(zhuǎn)入胞漿（跨膜移位）：

e.g.小RNA病毒3、病毒囊膜同細胞膜融合：由病毒的具有細胞融合活性的包膜糖蛋白介導(dǎo)

e.g.副粘病毒的F糖蛋白，單純皰疹病毒的gB糖蛋白，流感病毒。

目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點三、脫殼

脫殼是病毒侵入細胞后，病毒的包膜或殼體去除而病毒核酸釋放出來的過程，包括脫囊膜和脫衣殼兩個過程。噬菌體的脫殼與侵入一起發(fā)生；植物病毒脫殼方式了解較少；動物病毒由于不同的結(jié)構(gòu)類型和不同的侵入方式，脫殼過程較為復(fù)雜：目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點1、呼腸孤病毒，并不發(fā)生完全的脫殼，以內(nèi)吞方式進入細胞后，吞噬泡與溶酶體結(jié)合形成次級溶酶體，病毒外殼中近50%的殼體被溶酶體中的蛋白酶水解，余下的殼體與病毒核心形成亞病毒顆粒，病毒的基因組的轉(zhuǎn)錄均在亞病毒顆粒內(nèi)進行。目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點2、有些在細胞核內(nèi)增殖的DNA病毒，如乳多空病毒、腺病毒和皰疹病毒，其核衣殼在未被完全脫殼的情況下就進入細胞核3、口蹄疫病毒可能就在細胞膜上脫掉衣殼，病毒核酸直接進入細胞內(nèi)。

目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點4、痘病毒：較為特殊

外層囊膜在胞膜或吞飲泡膜上被融合,病毒核心進入胞漿內(nèi)，核心借助自身衣殼上的依賴DNA的RNA聚合酶合成mRNA，進一步譯制出一些早期蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)中有脫殼酶，該酶反過來幫助病毒核心進一步脫殼。目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點四、病毒大分子的合成隱蔽期（晦暗期）：從侵入細胞的病毒粒子消失開始，到新的病毒粒子出現(xiàn)為止的一段時間。痘病毒10h，脊髓灰質(zhì)炎病毒2~4h目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點病毒核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成可以分成幾個連續(xù)階段：1.mRNA的早期轉(zhuǎn)錄2.mRNA的早期翻譯——早期蛋白質(zhì)包括：1）酶：在病毒的核酸復(fù)制、晚期轉(zhuǎn)錄和晚期翻譯中發(fā)揮作用2）其它蛋白質(zhì)（功能蛋白質(zhì)）：參與改變或抑制宿主細胞大分子合成（影響細胞正常生物合成）。目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點3．病毒核酸的復(fù)制病毒核酸及其轉(zhuǎn)錄和復(fù)制分為6個基本類型目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第一類病毒的核酸復(fù)制1）雙鏈DNA病毒：呈半保留型復(fù)制（PRV）目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第二類病毒的核酸復(fù)制+2）單鏈DNA病毒（PPV）目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第三類病毒的核酸復(fù)制3）雙鏈RNA病毒（IBDV）保留型復(fù)制：指母代雙鏈在復(fù)制子鏈過程中，一方面產(chǎn)生子鏈，一方面母鏈又重新結(jié)合，結(jié)果在產(chǎn)生的兩個子代中，一個仍是母代原來的雙鏈。目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第四類病毒的核酸復(fù)制4）單股正鏈RNA病毒（FMDV）目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第五類病毒的核酸復(fù)制5）單股負(fù)鏈RNA病毒（NDV）

目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點第六類病毒的核酸復(fù)制6）反轉(zhuǎn)錄病毒（HIV）目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點4．mRNA的再度轉(zhuǎn)錄（晚期轉(zhuǎn)錄）在新合成的RNA聚合酶的作用下，由母代病毒和子代病毒的DNA進一步轉(zhuǎn)錄出第二批mRNA。某些RNA病毒則仍由RNA直接轉(zhuǎn)錄5．mRNA的再度譯制（晚期翻譯）晚期蛋白，包括病毒衣殼蛋白以及病毒編碼的其它蛋白。目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點五、裝配和釋放1．裝配：新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染細胞內(nèi)組裝成完整的病毒顆粒的過程。無囊膜病毒殼體與核酸結(jié)合形成的核衣殼即為成熟的病毒；囊膜病毒需要在核衣殼外加上包膜。病毒的裝配效率很低，往往只有不到50%的子代病毒成份能組裝成完整的病毒粒子。目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點裝配的機制：a.自我組裝（大多數(shù)病毒）：b.指導(dǎo)裝配：需要病毒基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（形態(tài)發(fā)生因子）的腳手架作用或蛋白質(zhì)水解的切割作用。目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點2．釋放

新形成的子代病毒粒子由細胞內(nèi)到細胞外的過程。1）細胞自身的溶解將病毒釋放出來2）不發(fā)生明顯細胞病變的病毒的釋放方式，目前還不十分清楚。目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點3）小RNA病毒合成速度極快，病毒粒子在胞漿內(nèi)大量積聚，在細胞死亡之前，就可脹破細胞、釋放病毒。4）有囊膜病毒的釋放過程也就是病毒衣殼獲得囊膜的過程。5）皰疹病毒很少釋出于細胞外，而是通過細胞間橋或融合細胞而傳播。目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點小結(jié)：不同病毒生物合成和裝配的場所不同

1．大多數(shù)DNA病毒：皰疹病毒、腺病毒、乳多空病毒在胞核內(nèi)合成DNA，裝配過程亦在胞核中進行。2．DNA病毒中的痘病毒和虹彩病毒在胞漿內(nèi)合成病毒DNA，其裝配也在胞漿內(nèi)完成。3．RNA病毒均在胞漿內(nèi)增殖。目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點§3病毒的非增殖性感染和缺損病毒

一．定義非增殖性感染：指病毒在感染細胞內(nèi)合成了某些甚至全部的病毒成分，但不能裝配成完整的具有感染性的子代病毒粒子的現(xiàn)象，稱為非增殖性感染（non-productiveinfection)或流產(chǎn)感染(abortiveinfection)

目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點缺損病毒：在感染細胞內(nèi)不能形成成熟病毒粒子的病毒。缺損病毒往往由于病毒基因組中一個或一個以上在病毒復(fù)制過程中較為重要的基因喪失了功能，導(dǎo)致病毒復(fù)制不能進行。目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點二．缺損病毒分類

1．依賴輔助病毒的缺損病毒1）干擾缺損（defectiveinterfering,DI）病毒：在病毒感染時產(chǎn)生的一類亞基因組缺失突變體。它們因失去了其親代病毒基因組中的復(fù)制必需片段，所以不能單獨進行復(fù)制，而必需在其同型的完全病毒（標(biāo)準(zhǔn)病毒）的輔助下，由完全病毒提供DI顆粒已喪失的、但又為復(fù)制所必需的基因功能才能復(fù)制。

目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點

標(biāo)準(zhǔn)病毒（standardvirus,SV）：與DI顆粒相關(guān)的完全病毒。2）衛(wèi)星病毒：存在于自然界中的一種絕對的缺損病毒，基因組與輔助病毒的DNA或RNA沒有任何的同源性。

e.g.細小病毒科中的腺聯(lián)病毒只能在有腺病毒或皰疹病毒感染的細胞內(nèi)復(fù)制。目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點2．偽裝性缺損病毒：指具有病毒衣殼及完整外表，但衣殼內(nèi)的病毒核酸被細胞源性的核酸完全所取代的缺損病毒。主要見于多瘤病毒和噬菌體。3．條件性缺損病毒：在一定條件下能增殖，但在其它條件下發(fā)生流產(chǎn)感染。如：溫度敏感突變株，宿主易感突變株目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點三、組織細胞培養(yǎng)（一）細胞原代細胞：應(yīng)用胰酶等分散劑將動物組織消化成單個細胞懸液，適當(dāng)洗滌以后，加入營養(yǎng)液，通常即可使其貼附于玻璃瓶壁上，并生長增殖。繼代細胞：將原代細胞從玻璃瓶壁上消化下來再作培養(yǎng)。目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點傳代細胞：由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細胞中有時出現(xiàn)惡性變細胞，也就是癌變細胞，這種病變細胞具有很高的增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限地傳代。優(yōu)點：1)可以無限的傳代。2)很多細胞系對病毒很敏感。3)某些傳代細胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4)生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點(二)細胞分散劑胰酶使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細胞間質(zhì)水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）

與鈣、鎂離子結(jié)合灰色鏈絲菌酶目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點（三）細胞的保存１．細胞培養(yǎng)物的常溫短期保存1）實驗室中細胞短期保存將已長成單層的細胞換液后置室溫或20-22℃下避光保存，可達15天以上。將細胞培養(yǎng)溫度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天傳代一次。目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點2）長途運送細胞培養(yǎng)物的保存取剛剛長成單層的細胞培養(yǎng)物，棄去營養(yǎng)液，加入維持液至滿瓶，勿使培養(yǎng)瓶內(nèi)存留空氣，隨后用橡皮塞緊塞瓶口，并作適當(dāng)?shù)陌＿\輸途中的溫度應(yīng)保持在15-25℃左右，到達目的地后，置37℃培養(yǎng)1天，再行傳代。目前三十九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點２.細胞培養(yǎng)物的長期保存將剛長滿單層的細胞，按細胞傳代方法消化吹散后，裝入離心管中，3000r/min5-10min，用適量的含有20%犢牛血清、10%二甲亞砜（DMSO）的DMEM懸浮，分裝于細胞凍存管中，置4℃2h，-20℃2h，-70℃過夜，然后置于液氮中長期保存?；蛟谝旱獨庀嘀羞^夜，然后置于液氮中長期保存?；蛑糜谝旱獨庀嘀校?min1cm的速度逐漸往下降直至液氮中長期保存。目前四十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點（四）細胞的復(fù)蘇將凍存于液氮中的細胞取出，迅速置于42℃~50℃水浴