高通量測(cè)序簡(jiǎn)介

高通量測(cè)序簡(jiǎn)介第1頁/共42頁主要內(nèi)容一、高通量測(cè)序簡(jiǎn)介二、Solexa和Semiconductor測(cè)序原理三、高通量測(cè)序部分應(yīng)用第2頁/共42頁高通量測(cè)序（High-throughputsequencing）又稱“下一代”測(cè)序（“Next-generation”sequencing），可一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序；可以對(duì)一個(gè)物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深入、細(xì)致和全貌的分析，所以又被稱為深度測(cè)序（Deepsequencing）。

一、高通量測(cè)序簡(jiǎn)介第3頁/共42頁高通量測(cè)序的發(fā)展1992年LynxTherapeuticsMPSS2003年P(guān)olonySequencing(哈佛）2005年454Pyrosequencing2006年SolexaSequencing-By-Synthesis2007年ABISOLID2008年HelicostSMSSequencing2009年IonTorrentSemiconductorSequencing2011年P(guān)icficBiosciencesSMRTSequencing第4頁/共42頁高通量測(cè)序的主要代表平臺(tái)有:羅氏的(Roche)的454測(cè)序儀（RocheGSFLXsequencer）;Illumina的Solexa基因組分析儀（IlluminaGenomeAnalyzer）;ABI的SOLiD測(cè)序儀（ABISOLiDsequencer）;ThermoFisher的離子半導(dǎo)體測(cè)序儀（IonSemiconductorsequencer).第5頁/共42頁Illuminasolexa文庫制備二、Solexa和Semiconductor測(cè)序原理第6頁/共42頁Lane1Lane2Lane8...TileEachlanecontains2columnsEachcolumncontains60tilesEachtileisimaged4

timespercycleFlowcell第7頁/共42頁簇生成，模板變性O(shè)HOHflowcelldiol

P7

P5dioldiolTemplatehybridizationdioldiolInitialextensiondioldiolDenaturation第8頁/共42頁橋式擴(kuò)增dioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=301stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionclusters第9頁/共42頁并行合成測(cè)序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端終止技術(shù)（ReversibleTerminatorChemistry）CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’ FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents DetectSignal CleaveTerminatorandDyeCycle2-n:Addsequencingreagents andrepeat第10頁/共42頁信號(hào)收集第11頁/共42頁讀取堿基序列在測(cè)序過程中，每種堿基被激發(fā)后都會(huì)發(fā)出特殊波長(zhǎng)的熒光在每個(gè)循環(huán)過程中每一個(gè)簇只對(duì)應(yīng)一張圖像第12頁/共42頁測(cè)序通量讀

長(zhǎng)測(cè)序時(shí)長(zhǎng)數(shù)據(jù)量2×150bp~29h100-200GB2×75bp18h50-80GB1×75bp11h25-30GB適用范圍全基因組測(cè)序、全外顯子測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序特

點(diǎn)高通量、靈活性、簡(jiǎn)便NextSeq500測(cè)序通量讀

長(zhǎng)測(cè)序時(shí)長(zhǎng)數(shù)據(jù)量2×75bp~24h3.3-3.8GB2×150bp~24h4.5-5.1GB2×250bp~39h7.8-8.5GB2×300bp~55h13.2-15GB適用范圍靶向測(cè)序、小基因組測(cè)序、靶向基因表達(dá)分析特

點(diǎn)唯一一臺(tái)在單次運(yùn)行產(chǎn)生2x300bp雙端reads的測(cè)序儀。MiSeqIllumina測(cè)序平臺(tái)展示第13頁/共42頁測(cè)序通量讀

長(zhǎng)測(cè)序時(shí)長(zhǎng)數(shù)據(jù)量2×150bp1-3.5d1300-1500GB1×75bp650-750GB1×50bp215-250GB適用范圍全基因組測(cè)序、全外顯子測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序特

點(diǎn)最高的通量，每個(gè)樣品的最低價(jià)格測(cè)序通量讀

長(zhǎng)測(cè)序時(shí)長(zhǎng)數(shù)據(jù)量2×150bp<3d單流動(dòng)槽

雙流動(dòng)槽8-9TB16-18TB適用范圍全基因組測(cè)序特

點(diǎn)超高的通量，有望突破人類全基因組測(cè)序的$1000大關(guān)Hiseq4000HiSeqXTen第14頁/共42頁NovaSeq6000流動(dòng)槽類型S1S2S3S4數(shù)據(jù)量a1×50bp167GB280-333GBN/AbN/Ab<19h1×75bp333GB560-667GBN/AbN/Ab<29h2×150bp500GB850-1000GB2000GB3000GB<40h適用范圍全基因組測(cè)序、靶向重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序特

點(diǎn)對(duì)幾乎任何基因組、任何測(cè)序方法和規(guī)模的項(xiàng)目，都有可擴(kuò)展的通量，靈活簡(jiǎn)便。所有產(chǎn)出和read數(shù)量規(guī)格都基于單個(gè)流動(dòng)槽計(jì)算，NovaSeq6000系統(tǒng)可同時(shí)運(yùn)行1個(gè)或2個(gè)流動(dòng)槽。b.N/A:不適用。第15頁/共42頁

IonSemiconductor測(cè)序流程第16頁/共42頁P(yáng)CR產(chǎn)物純化文庫制備第17頁/共42頁接頭連接第18頁/共42頁片段篩選第19頁/共42頁樣本混池第20頁/共42頁克隆擴(kuò)增第21頁/共42頁不理想的擴(kuò)增情況第22頁/共42頁ISP富集（IonSphereParticalEnrichment）擴(kuò)增引物的5’端標(biāo)記了生物素,通過鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠與標(biāo)記了生物素的DNA結(jié)合.第23頁/共42頁測(cè)序自然情況下，DNA聚合酶將一個(gè)核苷酸滲入到DNA分子中就會(huì)釋放出一個(gè)H+，導(dǎo)致局部可檢驗(yàn)的PH值發(fā)生變化，被離子傳感器檢測(cè)到，從而轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。第24頁/共42頁堿基識(shí)別依次摻入4中堿基連續(xù)兩個(gè)相同堿基結(jié)合第25頁/共42頁IonTorrentPGMIonTorrent儀器展示Chip類型PGM314PGM316PGM318傳感器數(shù)1.3M6.3M11M數(shù)

據(jù)

量~100MB~1GB~2GB運(yùn)行時(shí)間2.3/4.7h3.0/4.9h4.4/7.3h讀

長(zhǎng)200/400bp200/400bp200/400bp應(yīng)用范圍擴(kuò)增子測(cè)序、靶向重測(cè)序、小基因組測(cè)序特

點(diǎn)基于半導(dǎo)體技術(shù)測(cè)序原理，快速“讀”出堿DNA序列第26頁/共42頁高通量測(cè)序DNA全基因組測(cè)序人基因組重測(cè)序動(dòng)植物基因組測(cè)序微生物基因組測(cè)序外顯子組測(cè)序全外顯子組測(cè)序靶向捕獲測(cè)序（panel）甲基化測(cè)序擴(kuò)增子測(cè)序RNAmRNA測(cè)序LncRNA測(cè)序SmallRNA測(cè)序CircularRNA測(cè)序三、高通量測(cè)序部分應(yīng)用第27頁/共42頁全基因組測(cè)序全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，通過序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），插入缺失位點(diǎn)（InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（SV）位點(diǎn)和拷貝數(shù)變異位點(diǎn)（CNV)。全基因組denovo測(cè)序是指對(duì)未知基因組序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序，用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。第28頁/共42頁基因組測(cè)序策略第29頁/共42頁外顯子組測(cè)序外顯子組一個(gè)物種基因組中全部外顯子區(qū)域的總和；人外顯子組只占基因組的~1%，約30Mb；約85%的人類致病突變都位于這1%的蛋白質(zhì)編碼序列上。第30頁/共42頁文庫構(gòu)建Nimblegen、AgilentIllumina第31頁/共42頁mRNA測(cè)序(mRNAseq)是指利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序從而得到一個(gè)樣品中基因表達(dá)、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點(diǎn)、等位基因特異性表達(dá)和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。mRNA測(cè)序第32頁/共42頁文庫構(gòu)建擴(kuò)增文庫通過帶oligoT的磁珠分離出mRNA第33頁/共42頁LncRNA是一類長(zhǎng)度超過200nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，通過與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控基因表達(dá)。lncRNA測(cè)序是研究已有參考基因組物種的特定組織或細(xì)胞在某個(gè)特定時(shí)期轉(zhuǎn)錄出的所有l(wèi)ncRNA和mRNA。LncRNA（longnoncodingRNA)測(cè)序第34頁/共42頁文庫構(gòu)建第35頁/共42頁SmallRNA是長(zhǎng)度約20-30nt的非編碼RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活動(dòng)重要的調(diào)控因子，在基因表達(dá)調(diào)控、生物個(gè)體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。SmallRNA測(cè)序第36頁/共42頁文庫構(gòu)建第37頁/共42頁CircRNA是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達(dá)水平；這一作用機(jī)制被