血清清球蛋白分離新詳解演示文稿

血清清球蛋白分離新詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)二十五頁\編于點（優(yōu)選）血清清球蛋白分離新目前二頁\總數(shù)二十五頁\編于點3實驗?zāi)康恼莆整}析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法了解柱層析技術(shù)目前三頁\總數(shù)二十五頁\編于點實驗分組四個人一小組目前四頁\總數(shù)二十五頁\編于點5實驗過程鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）目前五頁\總數(shù)二十五頁\編于點6實驗材料人混合血清葡聚糖凝膠（G-25)層析柱DEAE纖維離子交換層析柱飽和硫酸銨溶液醋酸銨緩沖溶液20%磺基水楊酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽目前六頁\總數(shù)二十五頁\編于點7實驗原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學及其生物學功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。目前七頁\總數(shù)二十五頁\編于點8

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析★離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強度★降低介電常數(shù)電荷電泳★等電聚焦離子交換層析★特異結(jié)合部位親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析目前八頁\總數(shù)二十五頁\編于點9球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A目前九頁\總數(shù)二十五頁\編于點101.粗提（鹽析法）由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達到分離的目的。血清清蛋白球蛋白半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解目前十頁\總數(shù)二十五頁\編于點鹽析法鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機鹽至一定濃度或達飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。水化膜減弱、消失。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。目前十一頁\總數(shù)二十五頁\編于點122.脫鹽（凝膠層析）鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機鹽，必須先脫鹽后才能進一步純化。脫鹽有多種方法，本實驗采用凝膠層析法。凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)。目前十二頁\總數(shù)二十五頁\編于點凝膠層析分離示意圖目前十三頁\總數(shù)二十五頁\編于點14凝膠層析分離化合物示意圖目前十四頁\總數(shù)二十五頁\編于點153.純化（離子交換層析）離子交換層析是指流動相中的離子和固定相上的離子進行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進行分離R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+陽離子交換陰離子交換R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-目前十五頁\總數(shù)二十五頁\編于點16球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A目前十六頁\總數(shù)二十五頁\編于點0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白pI4.9，帶負電荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，帶負電荷少a、b球蛋白被洗脫,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5

，帶負電荷g–球蛋白pI＞6.5，帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強度增加清蛋白被洗脫目前十七頁\總數(shù)二十五頁\編于點18目前十八頁\總數(shù)二十五頁\編于點194.純度鑒定（電泳）血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果目前十九頁\總數(shù)二十五頁\編于點20球蛋白12等電點4.885.065.065.126.85~7.3相對分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點、平均分子量及正常含量清蛋白A目前二十頁\總數(shù)二十五頁\編于點21醋酸纖維素薄膜電泳原理血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。目前二十一頁\總數(shù)二十五頁\編于點22醋酸纖維素薄膜電泳1.點樣(粗面)8cm2cm點樣線點樣區(qū)1.5cm(粗面）點樣線盡量點得細窄而均勻,寧少勿多－＋小組標記樣品標記目前二十二頁\總數(shù)二十五頁\編于點232.電泳薄膜粗面向下點樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平注意：切勿使點樣處與電泳槽接觸電壓：110V時間：50min。目前二十三頁\總數(shù)二十五頁\編于點243.染色和漂洗電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。取出膜，用濾紙吸干即可。目前二十四頁\總數(shù)二十五頁\編于點用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì)取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì)凝膠柱層析除鹽磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時磺基水楊酸和BaCl2檢測可能同時陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）