基因工程的基本操作程序（第一課時(shí)）課件 【知識(shí)精講精析】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

復(fù)習(xí)——DNA的粗提取與鑒定如何分離DNA與蛋白質(zhì)？如何析出DNA？體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精（預(yù)冷）加入研磨液（SDS）研磨；加熱如何溶解DNA？2mol/L

NaCl如何鑒別DNA？在一定溫度下（沸水?。?，DNA被二苯胺試劑(現(xiàn)配現(xiàn)用)染成_______藍(lán)色復(fù)習(xí)——重組DNA技術(shù)的基本工具限制酶DNA連接酶載體①對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害；②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來(lái)源：主要來(lái)源于原核生物特點(diǎn)：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：種類：作用：

磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶把兩條雙鏈DNA片段拼接起來(lái)第2節(jié)基因工程的基本操作程序講課人：涂夢(mèng)婷第三章

基因工程培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的基本步驟普通棉花（無(wú)抗蟲特征）蘇云金芽孢桿菌（有抗蟲特征）提取抗蟲基因棉花細(xì)胞與載體DNA拼接，導(dǎo)入（含抗蟲基因）植物組織培養(yǎng)技術(shù)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因定義

用于__________________或___________________等的基因。改變受體細(xì)胞性狀獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物與生物抗逆性相關(guān)的基因與生產(chǎn)藥物相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等類型主要指：編碼蛋白質(zhì)的基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲。當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。目的基因定義

用于__________________或___________________等的基因。改變受體細(xì)胞性狀獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物主要指：編碼蛋白質(zhì)的基因目的基因的篩選從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。DNA測(cè)序儀序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)序列比對(duì)工具（如BLAST）目的基因的篩選目的基因的篩選從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。目的基因的篩選蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解蘇云金桿菌制劑可防治棉花蟲害Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因（1）人工合成在我國(guó)首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成DNA合成儀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉目的基因的獲取若不明確基因堿基序列呢？（1）人工合成在我國(guó)首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成DNA合成儀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉目的基因的獲取蛋白質(zhì)氨基酸序列mRNA序列基因序列若核酸序列未知——反轉(zhuǎn)錄法目的基因的獲?。?）從生物組織中直接獲取“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”①用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段②將這些片段分別連接到載體上，轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞并使其表達(dá)③若在某細(xì)胞中得到了目的產(chǎn)物，就說明該片段是所需的DNA片段③一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來(lái)優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，廣泛使用；速度快，成本低工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因目的基因的獲?。?）從基因文庫(kù)中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)部分基因文庫(kù)含有一種生物所有基因的文庫(kù)只含有一種生物部分基因的文庫(kù)（如：cDNA文庫(kù)）基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)補(bǔ)充——真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：不編碼蛋白質(zhì)，含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列

(如啟動(dòng)子、終止子）能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA（mRNA），能編碼蛋白質(zhì)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位，開始轉(zhuǎn)錄補(bǔ)充——原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)是連續(xù)的！目的基因的獲取（4）利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目的基因的獲取（4）利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因蘇云金桿菌Bt基因快速獲得大量Bt基因提取PCR技術(shù)PCR技術(shù)概念PCR全稱為___________________，是一項(xiàng)在生物________復(fù)制___________________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段①PCR的中文全稱：②操作環(huán)境：③目的：④原理：⑤優(yōu)點(diǎn)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制DNA半保留復(fù)制可以短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因資料：PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行。真核生物和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加

。Mg2+1）解旋在能量的驅(qū)動(dòng)下，解旋酶將DNA雙螺旋的兩條鏈解開，氫鍵斷裂。解旋酶ATP2）合成引物（補(bǔ)充）在引物酶的作用下，產(chǎn)生一小段RNA作為引物,后期引物會(huì)被切除引物酶引物5’3’引物的作用簡(jiǎn)單理解就是引出DNA聚合酶，因?yàn)镈NA聚合酶必須識(shí)別3’端才能結(jié)合上去。引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的

。短單鏈核酸3）合成子鏈DNA聚合酶等以解開的每一條母鏈為模板，以游離的4種脫氧核苷酸為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，各自合成與母鏈互補(bǔ)的一條子鏈。模板模板DNA聚合酶5’3’子鏈延伸方向子鏈延伸方向兩條子鏈延伸方向相反，但都是從5’→3’隨著模板鏈解旋過程的進(jìn)行，新合成的子鏈也在不斷延伸。子鏈母鏈母鏈5’3’5’3’3’3’5’5’子鏈4）重新螺旋每條新鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)。體內(nèi)DNA的半保留復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用打開DNA雙鏈的氫鍵提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈解旋酶DNA兩條母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸DNA的合成方向總是從子鏈的5＇端向3＇端延伸。解旋酶5＇端3＇端5＇端3＇端由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，所以需?/p>

引物。2種體內(nèi)DNA的半保留復(fù)制PCR技術(shù)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP-脫氧核苷三磷酸）兩種引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）實(shí)際加入的是dATPdGTPdCTPdTTPPPPA脫氧核糖~~PPPA核糖~~ATPdATPPCR技術(shù)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP-脫氧核苷三磷酸）兩種引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）實(shí)際加入的是dATPdGTPdCTPdTTPPPP堿基脫氧核糖~~（A、G、C、T）作用：既可作為合成DNA子鏈的原料，

又可為DNA的合成提供能量PCR技術(shù)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）兩種引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。PCR技術(shù)變性復(fù)性延伸溫度：90℃以上溫度：50℃左右過程：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與

兩條單鏈DNA結(jié)合溫度：72℃左右過程：4種脫氧核苷酸在耐高溫DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，添加在引物的_____端，合成新的DNA鏈。（引物結(jié)合在模板鏈的______端）反復(fù)循環(huán)過程：目的基因DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃院蠼饩蹫閱捂?’上一輪的產(chǎn)物作為下一輪的模板3’引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是：目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物的要求使用的一對(duì)引物的序列相同嗎？不相同，目的基因兩端具有不同的核苷酸序列①兩種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)（防止引物自身折疊）②兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)（防止引物之間配對(duì)，導(dǎo)致引物不能和模板鏈結(jié)合）DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈需要引物的原因是：項(xiàng)目PCR技術(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)場(chǎng)所解旋方式酶引物特點(diǎn)是否需要ATP溫度條件結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸均需要模板、引物、酶等細(xì)胞外（主要在PCR儀內(nèi)）（主要在細(xì)胞核內(nèi)）細(xì)胞內(nèi)DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、普通的DNA聚合酶一小段RNA或單鏈DNA分子片段一小段RNA體外迅速擴(kuò)增邊解旋邊復(fù)制不需要（dNTP提供）需要需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和的條件短時(shí)間內(nèi)可形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子PCR技術(shù)PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)含引物的DNA分子數(shù)含其中一種引物的DNA分子數(shù)同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)共消耗引物數(shù)共消耗引物對(duì)數(shù)含等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃變性3`5`5`3`PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃退火PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃延伸PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃變性PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃退火PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃延伸PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃變性PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃退火PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系905072℃延伸PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)含引物的DNA分子數(shù)含其中一種引物的DNA分子數(shù)同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)共消耗引物數(shù)共消耗引物對(duì)數(shù)含等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)22322448811000372614762n2n2n-12n-22n-12n+1-22n-2n思考：

PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中

分離出目的基因？3次PCR技術(shù)的數(shù)量關(guān)系練習(xí)1.DNA的復(fù)制需要引物，主要原因是(

)A．可加快DNA的復(fù)制速度B．引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶的延伸DNA鏈D．DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈D練習(xí)2.下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述，正確的是（

）A．該技術(shù)應(yīng)用體內(nèi)DNA半保留原理，也需要模板、原料、能量、酶等條件B．PCR技術(shù)建立在對(duì)擴(kuò)增的目的基因序列完全已知的