巨噬細胞的吞噬作用

巨噬細胞的吞噬作用——巨噬細胞體內(nèi)吞噬雞紅細胞實驗前言：病原微生物一旦突破體表防御屏障侵入體內(nèi)，首先接觸的是遍布全身的大、小吞噬細胞，他們分布于血液和組織中，并可以在某些趨化因子的作用下被吸引至微生物侵入部位。吞噬細胞依據(jù)其形態(tài)大小分為兩大類：一類是血液中的單核細胞及從血液游走到血管外并固定于各組織中的巨噬細胞，稱為大吞噬細胞；另一類是血液中的嗜中性粒細胞稱為小吞噬細胞。它們是機體非特異性免疫的重要因素。今我設(shè)計的實驗是檢測巨噬細胞的吞噬功能，淀粉可以在實驗動物腹腔內(nèi)引起非感染性炎癥滲出，在腹腔局部聚集較多巨噬細胞；將雞紅細胞注入實驗動物腹腔內(nèi)，可檢測腹腔內(nèi)的巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬功能?！緦嶒?zāi)康摹渴煜ぞ奘杉毎淌晒δ艿捏w外測定功能。【實驗原理】當雞紅細胞注入小鼠腹腔內(nèi)，巨噬細胞可借助細胞表面的免疫識別受體或直接吞噬雞紅細胞而將其消化，通過顯微鏡觀察該吞噬現(xiàn)象，可了解巨噬細胞的吞噬功能?！緦嶒灢牧霞霸噭┡渲啤浚?） 體重25g左右的小鼠。（2） 5ml、1ml無菌注射器，6號、9號針頭，10ml離心管，清潔載玻片，燒杯，解剖剪，眼科鑷，濕盒，解剖板，圖釘，37°C水浴箱。（3） 4%淀粉肉湯：稱面粉3克、可溶性淀粉5克、加營養(yǎng)肉湯至100ml,混勻，先微火加熱，不斷攪拌使成糊狀，再高壓滅菌。臨用時，與無菌營養(yǎng)肉湯等量混合。D-Hank’s液：NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO「H2O0.12g、KH2PO40.06g、葡萄糖1.0g、1%酚紅2.0ml。將上述成分溶于1000ml雙蒸水，分裝于500毫升鹽水瓶，8磅15min滅菌，4°C冰箱保存，臨用時用3.5%NaHCO調(diào)pH至7.2~7.4.3生理鹽水2%雞紅細胞：無菌操作抽取雞翅靜脈血，抗凝，置于離心管中，用無菌生理鹽水洗3次，最后一次離心2000r/min,10min，按積壓將雞血細胞用Hank’s液配成2%濃度。瑞氏染色液：稱取瑞氏染料0.1g、并量取甲醇60ml。先將染料放于乳缽中研細，加入少量甲醇再研，待染料全部溶解，倒入棕色瓶內(nèi)，并用余下的甲醇將乳缽中染料逐一洗入棕色瓶內(nèi)。加入3ml中性甘油，可防止染色時甲醇蒸發(fā)過快，同時使細胞染色較清晰。染色液保存時間越長，染色效果就越好。pH6.4~6.8磷酸鹽緩沖液20ml1%Na2HPO4，30ml1%KH2PO4，加蒸餾水至1000ml，混勻?！緦嶒灧椒ā繉嶒炃叭旖o小鼠腹腔內(nèi)注射1ml4%淀粉肉湯。實驗當天給小鼠腹腔內(nèi)注射Hank’s液3~4ml，輕揉腹部，讓小鼠活動10min。眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，并將小鼠釘在解剖班上。碘酒、酒精消毒腹部皮膚，左手持鑷提起腹中部，用解剖剪在皮膚上剪5mm長的小口，將皮膚朝頭尾部方向剝開，暴露腹壁。用鑷子提起腹壁，避開血管剪一小口，用5ml注射器或毛細吸管吸取腹腔液滴于載片上，每片2~3滴，并滴加等量的2%雞紅細胞懸液，充分混勻。將玻片置于濕盒內(nèi)，放37°C水浴箱內(nèi)35~45min，期間輕晃動玻片2次。取出后，將載玻片在生理鹽水中漂洗2次，洗去未吸附在玻片上的細胞。待其自然干燥。用瑞氏染色液染色于玻片上滴加瑞氏染色液數(shù)滴覆蓋蓋涂片，染色1min。滴加相當于染色液1.5倍量的pH6.8磷酸鹽緩沖液于涂片上，輕搖玻片，混勻染色液，染8~10min。流水沖洗，印干后用油鏡觀察結(jié)果【實驗結(jié)果】因巨噬細胞為貼壁生長細胞，能黏附在清潔載玻片上，故經(jīng)瑞氏染色后，鏡下可見巨噬細胞呈橢圓形、腎形或馬蹄形，其核較大，染色質(zhì)比較疏松，染成淡紫藍色，胞質(zhì)染成淺灰藍色，如有吞噬作用發(fā)生，可見巨噬細胞質(zhì)中有一個以上的有核雞紅細胞。如果吞噬的雞紅細胞較多，則巨噬細胞核被擠到一側(cè)，其形態(tài)不典型。隨機計數(shù)100個巨噬細胞，分別計數(shù)吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)和被吞噬的雞紅細胞總數(shù)。吞噬百分率二吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/100個巨噬細胞*100%吞噬指數(shù)=100個吞噬細胞中所吞噬的雞紅細胞數(shù)/100個巨噬細胞*100%此外，在計數(shù)時，應(yīng)同時注意雞RBC被消化的程度，分四級：I級未消化——胞質(zhì)淺紅色或淺黃綠色、胞核淺紫紅色。II級輕度消化一一胞質(zhì)淺黃綠色；胞核固縮，染成紫藍色。III級重度消化一一胞質(zhì)淡染，胞核成淺灰黃色。W級完全消化——巨噬細胞內(nèi)只見形狀似紅細胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。吞噬百分率和吞噬指數(shù)增高，表明機體大吞噬細胞的吞噬功能強，反之則吞噬能力弱。【注意事項】所有器材要干凈越接近涂片末梢細胞越多，估計數(shù)時應(yīng)取片子的前、中、后三段計數(shù)，以提高準確性。凡需要瑞氏染色的涂片必須在空氣中自然干燥后再染色，避免加熱干燥。否則細胞因受熱脫水而皺縮，影響吞噬現(xiàn)象的