雙向凝膠電泳技術(shù)原理與應(yīng)用

雙向凝膠電泳技術(shù)原理與應(yīng)用Principleandapplicationoftwo-dimensionalgelelectrophoresis姓名：XX班級(jí)：檢查本科1113班學(xué)號(hào)：XXX【摘要】人類基因組計(jì)劃與美國塞萊拉遺傳信息公司于2023年在美國《科學(xué)》雜志和英國《自然》雜志聯(lián)合宣布，他們繪制出了準(zhǔn)確、清楚、完整的人類基因組圖譜，至此，人類基因組計(jì)劃已基本完畢，隨著后基因組時(shí)代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)得到了空前的發(fā)展，蛋白質(zhì)組研究旨在揭示基因表達(dá)的真正執(zhí)行生命活動(dòng)的所有蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律和生物功能。涉及蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)等新的概念的提出，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為當(dāng)今生物領(lǐng)域中極其活躍的學(xué)科。其中雙向電泳（two-dimensionalelectrophoresis，2.DE）是蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一【abstract】HumangenegroupplansandUnitedStatessailailageneticinformationcompanyYu2023inUnitedStatesScienceundermagazineandUnitedKingdomnaturalundermagazinejointannounced,theydrawsouthasaccurate,andclear,andcompleteofhumangeneGroupmap,atthispoint,humangenegroupplanshasbasiccompleted,asHougenegrouperaofcomes,proteingrouplearngethasunprecedentedofdevelopment,proteingroupresearchaimedatrevealsgeneexpressofrealimplementationlifeactivitiesofallproteinofexpresslawandbiologicalfunction.Includesproteome,proteomics,structuralproteomicsandfunctionalgenomicsofnewconcepts,suchasproposed,proteomicshasbecomeextremelyactiveinthefieldofbiologicalsciences.Two-dimensionalgelelectrophoresis(two-dimensionalelectrophoresis,2.DE)isoneofthethreekeycoretechnologiesofproteomeresearch【關(guān)鍵詞】雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)；后基因組時(shí)代【keywords】two-dimensionalelectrophoresis，2.DEproteomicsPost-genomicsera【前言】由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量是兩個(gè)彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)，而2.DE同時(shí)運(yùn)用了蛋白質(zhì)間的這兩個(gè)性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)，因此2.DE的分離能力非常強(qiáng)大，它甚至能將細(xì)胞中的5000種蛋白分離開，2.DE在分離蛋白混合樣品、比較差異方面有不可替代的作用，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可查明大型蛋白復(fù)合物各組組分，與其他生物技術(shù)如分子生物學(xué)、分子遺傳工程、免疫學(xué)、微量蛋白質(zhì)的自動(dòng)氨基酸序列分析相結(jié)合，可以快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和鑒定新的蛋白質(zhì)?！緹晒舛縋CR的基本原理】【1-3】雙向電泳由于具有高分辨率和高靈敏度已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具［1］。自1975年O'Farrel等［2］建立這種技術(shù)后，已有許多改善，使得這一技術(shù)日趨完善。2-DE是運(yùn)用蛋白質(zhì)的帶點(diǎn)性和分子量大小的差異，通過兩次凝膠電泳達(dá)成分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。第歷來電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，通過等電聚焦電泳（isoelec-tricfocusing，IEF）將不同凈電荷的蛋白質(zhì)在PH梯度介質(zhì)中外加電場(chǎng)作用形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。然后將凝膠包埋在SDS凝膠板上端，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，在垂直或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），即第二向電泳;在IEF中，蛋白質(zhì)因等電點(diǎn)不同而被分離;在SDS.PAGE中，不同分子量的蛋白質(zhì)互相間被分離開，再用考馬斯亮蘭或銀染進(jìn)行檢測(cè)［3］，經(jīng)Pdquest等軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、解析。【雙向電泳技術(shù)應(yīng)用過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)】

1、樣品制備（蛋白提?。?/p>

（1）細(xì)胞培養(yǎng)、解決和收集;（2）將細(xì)胞在IEF裂解緩沖液中溶解;蛋白質(zhì)的溶解常采用品有8mol/L尿素、4%[3-(3-膽胺丙基)–丙磺酸]（SHAPS）、50~100mmol/LDTT和40mmol/LTris的樣品緩沖液。樣品溶解得不好會(huì)減少分離到的蛋白質(zhì)數(shù)量，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致等電聚焦時(shí)某些蛋白質(zhì)的沉淀，從而減少轉(zhuǎn)移到第二向電泳的蛋白質(zhì)數(shù)量。（3）將樣品離心以去除不溶的細(xì)胞碎片和DNA，提取上清，-80℃保存。2、蛋白質(zhì)定量和上樣

（1）第歷來電泳——等電聚焦;目前廣泛采用的是固相pH梯度（immobilinepHgradient，IPG）水平等電聚焦。常用固相PH梯度-道爾頓雙向電泳法（isoelectricpoint-dalton,ISO-DALT）。IPG膠的制備重要是運(yùn)用不同PK固定化電解質(zhì)的組合可配制不同PH范圍的凝膠。（2）IPG的平衡;由于第歷來電泳的緩沖液系統(tǒng)與第二向電泳的緩沖液系統(tǒng)完全不同，因此，膠條由第一轉(zhuǎn)移到第二之前，必須進(jìn)行平衡。平衡過程分兩步：第一步平衡液的成分重要是Tris緩沖液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的重要作用是使第歷來膠體上的蛋白質(zhì)變性。平衡液中的尿素和甘油可以增長溶液的粘度，減少由固相化的兩性電解質(zhì)導(dǎo)致的電內(nèi)滲。SDS用于變性蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電。DTT是為了在蛋白質(zhì)與SDS充足結(jié)合的同時(shí)，二硫鍵液得到還原；這對(duì)第二向SDS來講是十分重要的。第二步平衡液是用碘乙酰胺代替DTT。IPG膠條的平衡目的重要是進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化以及讓電泳介質(zhì)達(dá)成與第二向SDS相同的緩沖體系。（3）第二向SDS;由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，均帶有相同密度的負(fù)電荷，不再受蛋白質(zhì)原有的電荷和形狀的影響，而取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小。（4）蛋白質(zhì)檢測(cè)用考馬斯亮蘭染色或銀染色。銀染法是通過將膠浸泡于含陰離子的溶液內(nèi)，然后洗掉膠面上非緊密結(jié)合的金屬離子，加入某些試劑使與膠內(nèi)蛋白結(jié)合的銀離子形成金屬銀來顯色。效果如下圖：蛋白質(zhì)組譜呈滿天星狀（蛋白質(zhì)雙向圖譜中每個(gè)點(diǎn)代表樣本中的一個(gè)或數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)，根據(jù)Cartesin坐標(biāo)系統(tǒng)，從左到右顯示的是PI的增長，從下到上顯示的是分子質(zhì)量的增長）3、圖像分析及數(shù)據(jù)解決

將染色后的凝膠放在GS.710光密度掃描儀上，掃描后的圖像用PDQUEST2.D軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行比較。[IPG的優(yōu)點(diǎn)]【4】

（1）pH梯度穩(wěn)定、聚焦準(zhǔn)確、精度高;（2）無陰極漂移及堿性蛋白丟失的現(xiàn)象;（3）蛋白上樣量大，可提高低含量成分的分辨效果;（4）樣品中鹽的干擾少，無邊沿效應(yīng);（5）pH梯度、分離結(jié)果重現(xiàn)性好［4］。

[在雙向電泳應(yīng)用中所面臨的問題]

許多疏水性蛋白質(zhì)（如膜蛋白）不溶于樣品緩沖液，相對(duì)分子質(zhì)量過大（>200×103），極端酸性或堿性蛋白在電泳過程中易丟失，2.DE不能分辨。低含量組分易被高含量組分遮蔽，減少了分辨率。蛋白在提取和消化過程中的丟失、凝膠的污染、在不影響分辨率情況下的上樣量多少等都是尚待解決的問題。

[雙向電泳在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用]【5-15】

1人類疾病的蛋白質(zhì)組研究

(1)直腸癌直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活、癌基因活化的過程。Sanchez等［5］對(duì)15例結(jié)腸癌和13例正常人的結(jié)腸上皮進(jìn)行2.DE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量為13000和等電點(diǎn)（PI）值為5.6處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。其中15例患者的癌細(xì)胞中有13例13000.PI5.6蛋白有上調(diào)趨勢(shì)（87%）。此外，發(fā)現(xiàn)此種蛋白不僅在中度、低度分化的結(jié)腸癌及有24年病史的潰瘍性結(jié)腸炎過度表達(dá)，并且出現(xiàn)在7例分化限度不同腺瘤的癌前病灶中，但對(duì)照組則很少出現(xiàn)，這表白該蛋白的出現(xiàn)對(duì)檢測(cè)初期直腸癌有重要臨床意義。

(2)肝癌Peter等在用N.甲基.N.亞硝基脲誘導(dǎo)的小鼠肝癌中，用2.DE及氨基酸微型測(cè)序可分辯出肝癌誘導(dǎo)的醛糖還原酶樣的蛋白質(zhì)（35×103.PI7.4），此種蛋白質(zhì)在肝癌、胎肝中有高表達(dá)。經(jīng)免疫組化證實(shí)，肝癌誘導(dǎo)的醛糖還原酶樣的蛋白質(zhì)在成人肝臟中不表達(dá)，但在小鼠的肝癌中又重新表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白在癌前病變及肝癌中表達(dá)強(qiáng)烈，而在肝臟周邊的正常組織不表達(dá)［6］，表白該蛋白也許與肝癌的發(fā)病有很大關(guān)系。

(3)膀胱癌丹麥的一個(gè)小組運(yùn)用2.DE，并結(jié)合了蛋白印跡法、微型序列分析及質(zhì)譜技術(shù)分析了150例膀胱癌病人的組織，發(fā)現(xiàn)角蛋白10、14及銀屑病相關(guān)的脂肪酸結(jié)合蛋白等可作為膀胱癌不同分化限度的標(biāo)記物［7］。

(4)腎癌Sarto等［8］在對(duì)腎癌的研究中發(fā)現(xiàn)有4種蛋白質(zhì)存在于正常腎組織而在腎癌細(xì)胞中缺失，其中2種分別是輔酶Q蛋白色素還原酶和線粒體泛醌氧化.還原復(fù)合物I，這提醒線粒體功能低下也許在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用

(5)擴(kuò)張型心肌病擴(kuò)張型心肌病是一種嚴(yán)重的可導(dǎo)致心衰的心臟病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，推測(cè)也許為多種因素所致。Knecht等［9］采用2.DE取得了3300個(gè)心肌蛋白條帶，通過氨基酸序列分析，Edman降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI.MS）等分析了其中150條，經(jīng)活檢及病理檢查證實(shí)，有12條為擴(kuò)張型心肌病特有的蛋白。

(6)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）和骨性關(guān)節(jié)炎（OA）RA是一種常見的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病，常侵犯多個(gè)關(guān)節(jié)，主要累及手足小關(guān)節(jié)，病情遷延反復(fù)，重要的病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、細(xì)胞浸潤、血管翳形成、軟骨及骨組織侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，功能喪失。而OA的基本病理改變?yōu)槎喾N致病因素引起的進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及喪失，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨邊沿骨贅形成，由此引起一系列的關(guān)節(jié)癥狀和體征。有研究者［10］對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定滑膜細(xì)胞類型，提取蛋白進(jìn)行雙向電泳分離，比較RA與OA成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-likesynoviocytes，F(xiàn)LS）蛋白酪氨酸磷酸化狀態(tài)的差異。結(jié)果顯示:RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化較OAFLS明顯增多，其中以相對(duì)分子質(zhì)量42×103～95×103間蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)居多，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，RAFLS灰度掃描值為4227672±8947，OAFLS為663480±7962，RAFLS的灰度掃描值約為OAFLS的6.5倍，兩者具有非常顯著性差異（T=2.820，P<0.01）。1980年Hunter［11］一方面發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶（PTK），許多生長因子受體都具有PTK活性，一半以上的癌基因產(chǎn)物也具有PTK活性，他發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化比例雖小，但卻與細(xì)胞生長、增殖關(guān)系密切，很也許是正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞互相轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，癌基因活化后，PTK活性大大增長。1992年，Williams等［12］研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜細(xì)胞中的PTK活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OA，這也許是導(dǎo)致RA滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化特性而呈連續(xù)活化狀態(tài)的關(guān)鍵，作者推測(cè)RAFLS也許存在原癌基因的活化或突變，或多種生長因子受體的連續(xù)激活，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞的外觀表現(xiàn)并伴有PTK活性的增高

(7)其他目前許多研究者運(yùn)用2.DE對(duì)人體的各種組織、器官、細(xì)胞進(jìn)行了研究，為疾病的診治及了解發(fā)病機(jī)制提供了新的手段。如Bohring等［13］聯(lián)合雙向電泳與Western技術(shù)鑒定分離了高純度精子膜蛋白，發(fā)現(xiàn)了14種膜抗原。它們極有也許與男性不孕癥或輸精管切除患者體內(nèi)抗精子自身抗體SPAb結(jié)合，影響精子運(yùn)動(dòng)與頂體反映，為進(jìn)一步了解精子不育機(jī)制、擬定SPAb的存在找到了一個(gè)可行的方法。有作者［14］在酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用，導(dǎo)致許多蛋白的糖基缺少，如轉(zhuǎn)鐵蛋白。2致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

(1)檢測(cè)博氏疏螺旋體與免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)博氏疏螺旋體是萊姆病的重要因素，約有50%的未治患者發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)及關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病，該螺旋體分為3種類型:（1）B.burgdorferisensustricto，（2）B.garinii，（3）B.afzelii。其診斷由于血清學(xué)檢查的局限性而存在敏感性及特異性變化大的缺陷，為克服這一局限性，Peter等用2.DE從B.garinii得到217個(gè)銀染的蛋白斑點(diǎn)，從中用兔多克隆抗體鑒別出6個(gè)已知抗原，將不同臨床表現(xiàn)萊姆病患者的血漿用B.garinii2.DE圖雜交。用抗IgM及抗IgG作為第二抗體，在10例有游走性紅斑的患者血漿中，檢測(cè)出60～80個(gè)抗原，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎患者的血漿中，包具有抗15種抗原的IgM抗體及抗76種不同抗原的IgG抗體。而晚期有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀患者的血漿中，則包具有抗33種抗原的IgM抗體及抗76種抗原的IgG抗體。上述3種類型患者的血漿中均包具有抗6種已知抗原的抗體，且被SDS.PAGE雜交所證實(shí)，這些抗原均為特異性診斷的標(biāo)志物。

(2)弓形體抗原的檢測(cè)弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄生蟲病，假如懷孕的婦女在妊娠期受到感染，該蟲可通過胎盤引起胎兒感染，大約有50%新生兒由于母體的感染而引起先天性疾病。目前一般運(yùn)用血清學(xué)及PCR聯(lián)合測(cè)定，而單獨(dú)采用血清學(xué)如用IgG、IgM或IgA抗體測(cè)定對(duì)疾病活動(dòng)期敏感性不夠，特別對(duì)于妊娠或有免疫克制的患者，因此臨床上能否做到初期診斷，而使患者得到初期治療尤為重要。Jungblut等［6］將鼠弓形體蟲RH株在人羊膜細(xì)胞系FL521中表達(dá)后，用2.DE得到300個(gè)銀染斑點(diǎn)，再將其與以下3種患者的血漿進(jìn)行免疫雜交:（1）患有急性弓形體病的妊娠婦女（n=11）;（2）患急性弓形體病的非妊娠婦女（n=6）;（3）有潛在感染的患者（n=9）。結(jié)果有9個(gè)斑點(diǎn)對(duì)各階段的弓形體感染均反映，這9種斑點(diǎn)被用來當(dāng)作弓形體感染的標(biāo)記，其中7種標(biāo)記可用作區(qū)別疾病的不同階段。

(3)新抗生素作用機(jī)制的研究在新抗生素作用機(jī)制的研究方面，2.DE技術(shù)發(fā)揮了重要作用。因現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗藥性，而用于臨床的抗生素幾乎都是原有抗生素的衍生物，目前這種狀態(tài)有所改變，在研究克制核糖體類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí)，對(duì)12種作用于翻譯過程不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察，發(fā)現(xiàn)了其中8種誘導(dǎo)冷休克反映的一系列蛋白質(zhì)及另4種誘導(dǎo)一系列熱休克反映的蛋白質(zhì)，因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反映，并且藉此可推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱休克的反映發(fā)生于核糖體水平上［15］。

由此可見雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它在分離蛋白質(zhì)譜的應(yīng)用引起了蛋白質(zhì)生化和功能分析方法的復(fù)興。我們相信隨著蛋白質(zhì)組研究技術(shù)體系的不斷改善和發(fā)展，為人類從蛋白質(zhì)水平上揭開生命活動(dòng)規(guī)律的那一天終究會(huì)到來。

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