香菇多糖的研究

香菇菇活性多糖研究的進展姓名：***專業(yè)：食品科學與工程學號：***指導老師：劉璘摘要香菇多糖是從香菇的子實體或發(fā)酵菌絲體中提取的多糖分子．由于分離方法的差異，所得多糖分子的結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系亦有很大的不同。目前，研究較多的是具有分支的以8(1—3)糖苷鍵連接的吡喃葡聚糖，作為免疫激活劑已廣泛地應用于抗腫瘤臨床實踐中．香菇(Lentiusedodes)為擔子菌綱傘形科真菌，是世界上第2大食用菌。香菇是藥食兩用菌類，作為食用菌，由于其營養(yǎng)豐富，歷來受到人們的愛慕；作為藥物，由于其具有香菇多糖、香菇嘌呤、氨基酸等多種有效成分而倍受藥物研究工作者的關(guān)注，特別是其中香菇多糖的抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫功能等作用被發(fā)現(xiàn)以后，其研究更進一步、更多元化。中醫(yī)理論認為香菇具有多種功效。香菇多糖是香菇中最重要的一種生物活性物質(zhì)，作為一種免疫促進劑，在20世紀60年代已引起人們廣泛的愛好．現(xiàn)代研究表白：香菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗氧化等功能。有關(guān)香菇多糖的研究，特別是結(jié)構(gòu)方面的研究已引起國內(nèi)外學者的高度關(guān)注，并有望成為多糖領域的研究熱點。發(fā)展史-----香菇多糖生物活性研究進展1香菇多糖簡介及國內(nèi)外研究概況多糖的來源大體分為植物來源多糖、動物來源多糖、海藻來源多糖和微生物來源多糖即細菌產(chǎn)生的多糖和真菌產(chǎn)生的多糖,這是至今研究得比較詳盡的一類多糖。迄今為止,幾百種天然多糖的發(fā)現(xiàn),已給人類提供了豐富的生物多聚體寶庫。真菌多糖作為藥物研究始于50年代,在60年代以后成為免疫促進劑而引起人們愛好。香菇多糖就是研究得較透徹的多糖之一,香菇(Lentinusedodes(Berk.)Sing)是側(cè)耳科(Pleurotaceae)的擔子菌,世界名貴食用兼藥用菌之一,它具有多種有效藥用組分,特別是它具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能的香菇多糖(lentinan簡稱LNT)增強人體免疫力的水溶性木質(zhì)素這2種藥用生理活性物質(zhì),而引起人們廣泛的重視。LNT的藥理作用是它并非直接襲擊致病源,而是通過刺激免疫細胞成熟、分化和增殖,改善宿主機體平衡,達成恢復和提高宿主細胞對淋巴因子、激素及其它生理活性因子的反映性。因此,人們常稱LNT為生物反映修飾劑(biologicalresponsemodifier,BRM)。1968年日本千原吳郎一方面運用熱水從香菇子實體中浸提出6種胞外LNT,1970年Chihard和Sasaki用熱水浸提結(jié)合有機溶劑沉淀從香菇中提取到此外4種多糖,80年代以來,LNT的研究更為進一步、多元化。如Schulty從深層發(fā)酵香菇菌絲體中提取到一種胞內(nèi)多糖KS2,是一種相對分子質(zhì)量在(6.0～9.5)×10^4之間,含α鏈的甘露糖苷,并伴有少量肽類(由絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸構(gòu)成)的免疫活性物質(zhì)。盡管有關(guān)LNT的成分和結(jié)構(gòu)報道甚多,但已明確結(jié)構(gòu)與免疫活性關(guān)系的只有β-葡聚糖物質(zhì)。該多糖的一級結(jié)構(gòu)具有β-D(1→3)連接的毗喃葡聚糖主鏈,在主鏈中葡萄糖的C6位上具有支點(每5個D-葡萄糖有2個支點),其側(cè)鏈是由β-D(1→6)鍵和β-D(1→3)鍵相連的D-葡萄糖聚合體組成,在側(cè)鏈上也具有少數(shù)內(nèi)部β-D(1→6)鍵?，F(xiàn)己知道:水溶性β-D葡聚糖為線狀結(jié)構(gòu),無長分枝。另一些香菇中的多糖物質(zhì)由D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖所組成,也有來源于深層發(fā)酵香菇菌絲體中的α-甘露糖苷,這也許因提取方法和原料(涉及香菇來源品種及部位)的不同所致。蛋白質(zhì)、核酸和多(寡)糖為最重要的3種生物大分子。糖類的研究工作和蛋白質(zhì)、核酸的研究工作相比,在我國還是一個薄弱環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在國際上多糖研究以日本、美國、德國、加拿大處在領先地位,我國多糖的研究起步較晚,通過一個相對寂靜的時期以后,自80年代各地的研究如雨后春筍般掀起。目前,國內(nèi)外己從高等擔子菌中篩選到200余種有生物活性的多糖物質(zhì),我國發(fā)現(xiàn)有價值的真菌多糖有28種。其中化學結(jié)構(gòu)較清楚的15種。國內(nèi)外研究的重要目的是:一方面通過對LNT藥理和臨床實驗的研究進一步尋找活性更高,特別是對腫瘤、艾滋病更有效的多糖:另一方面進行構(gòu)效關(guān)系的研究,通過對LNT化學修飾的研究,以尋找更有效的多糖藥物。這將不僅對發(fā)現(xiàn)新多糖起指導作用,并且對藥物學、分子生物學的理論作出新奉獻。香菇多糖生物活性機制研究前沿隨著分子生物學的發(fā)展和香菇多糖研究的不斷進一步,科學家們已經(jīng)開始在基因水平探討香菇多糖生物活性的機制。香菇多糖在不同品系小鼠中的抗腫瘤活性有較大差異,在DBA/2、SWM/MS和A/J等小鼠中抗腫瘤活性明顯,而在Balb/C、C57BL/6和C3H/HE等小鼠中則不明顯。研究香菇多糖對不同品系小鼠的巨噬細胞分泌細胞毒素及TNF的影響,也發(fā)現(xiàn)香菇多糖的生物活性與基因型有密切關(guān)系,巨噬細胞毒素的產(chǎn)生受H2基因和背景基因的影響,而TNF的產(chǎn)生則只受H2基因的影響。交聯(lián)分析表白,香菇多糖引起顯著的VDH是由多基因調(diào)控的,其中優(yōu)勢基因Ltnr3、次要基因Ltnr4、ltnr5、ltnr6分別定位于第6、9、15、16號染色體上,而DTAPP反映則是由兩個隱型基因調(diào)控的,Ltnr1、Ltnr2分別位于第3、11號染色體上。香菇多糖免疫調(diào)節(jié)的基因定位無疑為溝通多糖、蛋白質(zhì)、核酸間的活性調(diào)節(jié)關(guān)系架起一座新橋梁。多糖生物活性與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系的研究還落后于核酸與蛋白質(zhì)的研究。有關(guān)香菇多糖的成分和結(jié)構(gòu)的報道甚多,但明確和免疫活性有關(guān)的只有β-1,3葡聚糖物質(zhì),該多糖的一級結(jié)構(gòu)具有β-D-1,3吡喃葡聚糖主鏈,C6上帶有分支側(cè)鏈,β-1,3和β-1,6結(jié)合的側(cè)鏈共存是抗腫瘤活性所必不可少的。此外,二、三級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)更具免疫活性,X衍射和粘度分析發(fā)現(xiàn),香菇多糖的β三維螺旋一旦破壞,免疫活性隨之消失。有關(guān)多糖受體的發(fā)現(xiàn)對闡明其作用機制有重要意義。多糖具有抗原性,可以推測其分子中也存在活性決定簇。對兔進行亞急性免疫可得到anti-LNT-Ab,該抗體具有辨認LNT的特異性,不辨認其他多糖如淀粉、葡聚糖等[17],以此可以方便地用ELISA方法來檢測樣品中LNT[18]。anti-LNT-Ab的研究可為探測香菇多糖受體及其活性決定簇的分子結(jié)構(gòu)基礎提供根據(jù)。作用1香菇多糖免疫調(diào)節(jié)活性香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性是其生物活性的重要基礎。香菇多糖是典型的T細胞激活劑,體內(nèi)外均能促進細胞毒T淋巴細胞(CTL)的產(chǎn)生,提高CTL的殺傷活力,增強正常或免疫功能低下小鼠的遲發(fā)型超敏反映(DTH),提高抗體依賴性細胞毒細胞(ADDC)活性。香菇多糖在體內(nèi)一方面誘導巨噬細胞產(chǎn)生急相蛋自誘導因子(APPIF),隨后血清中出現(xiàn)血管膨脹出血誘導因子(VDHIF)、白細胞介素1誘導因子(IL1PF)、IL3(CSF)等。這些因子再作用于淋巴細胞、肝細胞、血管內(nèi)皮細胞等,導致與免疫和炎癥有關(guān)的許多免疫應答的產(chǎn)生。香菇多糖的抗腫瘤活性能被巨噬細胞拮抗劑所阻抑,因此認為,香菇多糖是一種胸腺依賴型T細胞導向,并有巨噬細胞參與的免疫調(diào)節(jié)劑。香菇多糖在體內(nèi)能激活NK細胞,而體外不能;其激活NK細胞與促進干擾素(IFN)的分泌有關(guān)。香菇多糖受體內(nèi)給藥12小時后IFN分泌量可達成高峰。此外,香菇多糖還能激活補體系統(tǒng),促進抗體生成,使巨噬細胞溶酶體酶和IL1分泌量增長,而克制巨噬細胞釋放PGE、PGF。PGs是免疫系統(tǒng)克制劑,這是香菇多糖提高機體免疫功能的重要因素。免疫系統(tǒng)是由各種免疫細胞和免疫因子互相促進或克制組成的復雜網(wǎng)絡系統(tǒng)。為研究香菇多糖免疫調(diào)節(jié)活性的觸發(fā)機制,Oka等[1]設想香菇多糖必須一方面結(jié)合到宿主細胞上,通過體外香菇多糖與宿主細胞共培養(yǎng),流式細胞儀免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)多數(shù)香菇多糖能結(jié)合到人單核細胞上,這種結(jié)合作用受antiCR3mAb克制,能被antiCR1mAb強烈克制,而被antiCR1mAb+antiCR3mAb完全克制。體內(nèi)注射香菇多糖3～4小時,外周血中結(jié)合香菇多糖的單核細胞數(shù)明顯上升,5小時后又降到低水平。這一過程中未發(fā)現(xiàn)結(jié)合香菇多糖的中性粒細胞和淋巴細胞。因此認為香菇多糖結(jié)合到人單核細胞上也許是其影響免疫系統(tǒng)的首要因素。2香菇多糖抗感染作用據(jù)報道香菇多糖可用于治療結(jié)核桿菌感染,能使耐藥性結(jié)核病人痰菌轉(zhuǎn)陰,病人外周血嗜中性粒細胞吞噬活性增長。香菇多糖還能延長李司忒氏菌感染小鼠的生存時間,這與其提高巨噬細胞功能有關(guān)。香菇多糖對泡狀口炎病毒感染引起的小鼠腦炎有顯著的治療和防止作用,治療組100%存活而對照組所有死亡。香菇多糖對Abelson病毒、A2(H2N2)病毒、12型腺病毒及流感病毒感染均有克制作用,是治療各種肝炎特別是慢性遷移型肝炎的良好藥物。香菇多糖抗病毒作用與其誘生IFN和提高NK細胞活性有關(guān)。香菇多糖抗感染的機制與多糖自身的特性有關(guān)。病原體表面的糖蛋白辨認正常細胞表面的糖分子并發(fā)生粘附作用,是引起感染的必要前提。體液中游離的糖分子可以與病毒結(jié)合起到屏蔽作用,因此糖分子的干擾也是其抗感染的機制之一。HIV是日前最難對付的病毒之一。硫酸化香菇多糖具有顯著抗HIV作用,體外10mg/L就完全克制HIV抗原的表達,干擾HIV對MT4細胞的侵染,克制合胞體形成;臨床使用能協(xié)同疊氮胸苷(AZT)更好地克制HIV抗原的表達。3香菇多糖的抗腫瘤作用香菇多糖能有效防止化學性或病毒性腫瘤的發(fā)生,對小鼠S180實體瘤的克制率可達70%～100%,其中90%小鼠的腫瘤完全消退;還能克制化學致癌劑3甲蔥酮的致癌作用,防止小鼠腸潰瘍惡化導致的結(jié)腸癌的發(fā)生。香菇多糖是通過CTL、MΦ、NK、ADDC、LAK等細胞發(fā)揮抗腫瘤作用的。這與免疫監(jiān)視學說觀點一致,后者認為,機體免疫系統(tǒng)可以通過細胞免疫機制殺滅腫瘤,CTL、MΦ、NK、ADDC、LAK等細胞組成防治腫瘤的強大細胞免疫體系。香菇多糖在治療胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等方面具有良好療效。作為免疫輔助藥物,香菇多糖重要用來克制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移,提高腫瘤對化療藥物的敏感性,改善患者的身體狀況,延長其壽命。香菇多糖與化療劑聯(lián)合使用有減毒增效的作用,它能通過免疫調(diào)節(jié)作用或影響一些關(guān)鍵酶的活性,來提高腫瘤對化療藥的敏感性。如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)是幫助腫瘤產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵酶,在順鉑(CDDP)克制小鼠結(jié)腸26腫瘤的實驗中,LNT+CDDP組的抑瘤率顯著高于單獨用CDDP組或?qū)φ战M,而GST酶活顯著低于對照組,說明香菇多糖提高腫瘤對CDDP的敏感性,與影響GST活性有關(guān)。嘧啶核苷磷酸酶能催化5DFUR生成5FU,該酶可被腫瘤細胞中多種細胞因子誘導。香菇多糖與5DFUR聯(lián)合用藥能顯著提高后者對AH66腫瘤的克制率;香菇多糖組的該酶活性顯著高于對照組;聯(lián)合用藥組腫瘤產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(TNF)和腫瘤生長因子(TGF)顯著少于對照組。表白香菇多糖能特異性誘導腫瘤中嘧啶核苷磷酸酶活性,提高腫瘤對5DFUR的敏感性。提取與分離。1材料與方法材料實驗材料:干香菇。實驗試劑;氯仿、正丁醇、乙醇、甲醇、NaCl、葡萄糖甘露糖、木糖、乙醚等均為分析純。原料的解決:粉碎法。具體分三種情況,一是將原料粉碎成可過80目的篩子;二是將原料粉碎成直徑為2-3mm的顆粒;三是不粉碎。加水量的選擇:設加水量分別為:原料/無離子水(W/W)=1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30。按上述比例分別進行蒸煮。蒸煮溫度的選擇:設蒸煮溫度分別為85,96,105,120℃。其中,前兩個溫度蒸煮3-5hrs,后兩溫度個蒸煮40-80Mins蒸煮物的過濾:采用壓濾法。濾液的濃縮:采用熱濃法。將濾液倒入濃縮鍋中,在92-94℃條件下加熱,直至濾液的體積降為本來的1/4—1/5多糖的沉淀與脫色:采用乙醇法。向濃縮液中加入95-99%的乙醇至50,60,70,80%飽和度。多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除:采用BECM法。即將正丁醇、乙醇、氯仿、甲醇、NaCl按一定比例混制成一種特殊的試劑,然后加到多糖溶液中。攪拌20-30Mins后靜置6-10hrs。多糖的分級純化:用甲醇分級沉淀法。向多糖溶液中分別加入一定比例的甲醇,3000rpm離心15mins。將分級的樣品分別測其比旋,并用酸完全水解,作紙層析。多糖的干燥:分別采用自然干燥法,高溫烘干法和凍干法三種方法。自然干燥法的條件是25℃96hrs;高溫烘干法采用70℃48hrs和105℃16hrs;凍干法為真空度20-50pa多糖總量測定:采用苯酚———硫酸法(9)。以葡萄糖為標準品。工藝流程:原料→烘干→粉碎→稱重→調(diào)配→熱水抽提→過濾→濾液→脫色→醇析→復溶→去除雜蛋白→分級沉淀→香菇多糖→干燥。2結(jié)果與討論較佳的粉碎度不同粉碎度的實驗結(jié)果表白,以粒徑為2-3mm的香菇顆粒為好。較細的顆粒雖然有助于多糖的浸出,但給后面的分離過濾導致困難,使粗多糖溶液大量流失,因此最后得率并不高;整塊香菇子實體不經(jīng)粉碎直接進行蒸煮抽提,雖然不存在過濾問題,但是香菇子實體體積太大,不利于多糖的浸出,因此效果不及粒徑為2-3mm的香菇顆粒子.較適的加水量不同加水量的實驗結(jié)果表白,原料/無離子水(W/W)=1∶20～1∶25為好。若加水過少,在沒有達成最佳蒸煮時間之前,浸出液已經(jīng)變得很少,甚至糊鍋,從而影響多糖得率;若加水過多,則浸出液過多,不利于以后的分離濃縮。適宜的蒸煮溫度不同蒸煮溫度的實驗結(jié)果表白,在96℃條件下蒸煮3～4hrs,可以達成較高的多糖得率。溫度過低(85℃),溶劑的滲透能力和溶解能力減少,使多糖不能有效的溶出;溫度過高(100℃以上)導致多糖的裂解,使多糖得率醇析作用對多糖得率的影響取一定量的多糖浸提液分裝于4支試管中,并依次加入無水乙醇,直至乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%,放置一定期間后,離心收集沉淀并烘干稱重,乙醇終濃度在70%左右時效果最佳,經(jīng)醇析后沉淀即為多糖粗品。215多糖粗品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除BECM法脫蛋白的結(jié)果表白,雜蛋白的去除率為99.198%。BECM法不僅雜蛋白的去除率高,并且工藝簡樸,無需大的動力和設備,大大減少了運轉(zhuǎn)成本。216多糖的分級純化用甲醇分級沉淀法可將去除雜蛋白的多糖分為L1,L2,L3三個級分,分別測其比旋,并用酸完全水解L1,L2,L3,作紙層析結(jié)合苯酚———硫酸法的測定結(jié)果表白,L1,L2,L3的葡聚糖含量分別為68.109%，79.125%,100%。217多糖的干燥多糖的干燥方法雖有多種,如自然干燥法,高溫烘干法,真空低溫冷凍干燥法等,但自然干燥法耗時太長且干燥不徹底。而高溫烘干法中70℃48hrs的條件下,不僅耗時仍較長,并且有部分多糖被降解;105℃16hrs這樣的條件下,雖然干燥很徹底,但多糖降解嚴重。真空低溫冷凍干燥法雖然能耗較多,但條件溫和結(jié)論香菇素以色、香、味俱佳而著稱,堪稱食用菌中的上品。近幾十年來的研究發(fā)現(xiàn),香菇中具有一種能治療癌癥,抗惡性腫瘤,抗病毒,抗感染,提高人體免疫力等多種生理功能的物質(zhì)———香菇多糖。醫(yī)學研究證明,它是通過刺激機體的免疫系統(tǒng)使機體的免疫功能得到恢復和提高,由機體自身的抵抗力去殺死腫瘤細胞。它的作用是間接的,所以毒副作用小,在各類抗癌藥物中,它被認為是毒副作用可以忽略不計,劑量低,療效好的天然的抱負藥物。香菇多糖1969年在日本一方面發(fā)現(xiàn),關(guān)于其抗惡性腫瘤,抗病毒,抗感染等生理功能的報道已不少,關(guān)于運用多種原料發(fā)酵法生產(chǎn)香菇多糖的研究也時有報道,至于如何獲得純凈的香菇多糖則所見報道不多。由于文獻所介紹的方法因工藝復雜,收率低,而使成本高,售價高達60美元/mg,普通腫瘤病人無法接受。參考文獻：[1]楊曉彤，摩可，楊慶堯等．香菇菌絲體多糖LeBD1—1的分離純化和分析[J]．微生物學報，1997，37[2]白潤江，馬端端，王嘉軍，等．香菇多糖對小鼠血漿、胸腺、脾臟cAMP、cGMP含量的影響[J]．西安醫(yī)科大學學報，1997，18(1)[3]黃迪南，侯敏，祝其鋒．香菇多糖對小鼠腹腔巨嗜細胞一氧化氮生成的影響及其機理[J]．基礎醫(yī)學與臨床，1999，19(3)[4]王強，王京杭，張靜，等．LNT—rIL一2免疫原性研究[J]．中國免疫學雜志，1998，14(2)[5]盛劍秋，段芳齡，楊淑英．香菇多糖脂質(zhì)體聯(lián)合IL一