人類基因組提取

關(guān)于人類基因組提取第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月人類基因組DNA的提取第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月提取方法:1·從全血中提取2·從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月(全血）原理：細(xì)胞裂解液：裂解細(xì)胞膜，收集細(xì)胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離下來苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白質(zhì)無水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗滌DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（全血）操作方法：細(xì)胞裂解與RNase/蛋白酶K消化

1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppendorf離心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器來回吹打混勻，室于55℃溫浴35分鐘，其間來回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。

2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，隨后加入1250μl結(jié)合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000rpm離心30秒。第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA與吸附柱結(jié)合

3．用移液器Tip轉(zhuǎn)移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

注意：待轉(zhuǎn)移上清約1300μl，離心吸附柱容量約650μl，故需每次轉(zhuǎn)移上清650μl到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作步驟3。第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA的純化:

4.再加入600μl洗滌緩沖液（washingbuffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm離心30秒。

5．重復(fù)步驟4一次，12，000rpm離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。

6．小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個(gè)干凈的1.5mlEppendorf離心管，并加入50μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000rpm離心30秒。

7．取出Eppendorf離心管，其中便是所提取基因組NA。第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（口腔上皮脫落細(xì)胞）原理

哺乳動(dòng)物的一切有核細(xì)胞都可以用來制備DNA,除特殊要求外，白細(xì)胞，肝或脾組織是最常用的的材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細(xì)胞，有時(shí)為了簡易，還可以無創(chuàng)傷的采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或絨毛膜細(xì)胞；

第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（口腔上皮脫落細(xì)胞）操作方法：1、用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；重復(fù)1次。2、沉淀中加1ml1×細(xì)胞核裂解液(STE)，打散細(xì)胞團(tuán)、混勻，再加酶解混合液（含350μlSTE、150μl10%SDS和10μl20mg/ml蛋白酶K），搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。37℃溫箱過夜或50℃3~4小時(shí)。第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月3、加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10分鐘，室溫2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。5、重復(fù)步驟4一次。第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月6、將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100μlTE中。7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70℃保存。第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、概念核酸酶內(nèi)切酶外切酶限制性核酸內(nèi)切酶：能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并裂解磷酸二酯鍵第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、分類分類依據(jù)：酶的基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、依賴的輔助因子及與DNA結(jié)合和裂解的特異性特性I類II類III類內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶限制和修飾活性3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基所需輔助因子ATM,Mg2+,SAMMg2+ATM,Mg2+,SAM寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000pb處隨機(jī)切開一條單鏈位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3‘端24-26pb處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)識(shí)別為甲基化的序列進(jìn)行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用作用不大第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月三、作用機(jī)制以環(huán)狀或線性的雙鏈DNA為底物，在合適的反應(yīng)條件下，識(shí)別特定的核苷酸序列，使兩條核苷酸糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷裂，兩裂口之間的堿基對(duì)的氫鍵也隨之?dāng)嚅_，產(chǎn)生具有3’-羥基和5‘-磷酸基的DNA片段。第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月四、切割方法識(shí)別和切割位點(diǎn)

4-6個(gè)堿基對(duì)且具有回文序列的DNA片段大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割產(chǎn)生5’或者3‘黏性末端例如：EcoRI切割后產(chǎn)生5’黏性末端5‘-G↓AATTC-3’5‘-GAATTC-3'3’-CTTAA↑G-5'3‘-CTTAAG-5'第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月黏性末端第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月平末端有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生的末端稱為平端或鈍端例如:SmaI第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月同工異源酶

來源不同的酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)如BamHI和BstI(G↓GATCC)同尾酶

有些限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列不同，但是產(chǎn)生相同的黏性末端。如BamHI（G↓GATCC）和Sau3AI(N↓GATCN)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

瓊脂糖凝膠:天然瓊脂是一種多聚糖，主要由瓊脂糖及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些集團(tuán)帶有點(diǎn)荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是瓊脂糖凝膠電泳？

瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂凝膠分子篩作用，核算片段因其分子量或者分子形狀不同，電泳速度有差異而分離。這種技術(shù)是基因操作的一種方法。第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力,同時(shí)也由此造成了經(jīng)過一定時(shí)間的泳動(dòng)后按大小形成的一條“條帶”。其中線狀的DNA可以通過。第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳原理:

核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極遷移．使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離結(jié)果與核酸的分子量、分子構(gòu)型和凝膠濃度密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。通過比較標(biāo)準(zhǔn)物與未知片段的移動(dòng)距離便可測出未知片段的大小。但當(dāng)DNA分子超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難講它們分開。第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月1)核酸的分子量質(zhì)粒DNA有三種形式1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在

2、開環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子

3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2）核酸構(gòu)型

不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移速率主要取決于凝膠濃度，同時(shí)也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月①

超螺旋DNA：

盡管質(zhì)粒通常以開環(huán)的形式進(jìn)行描述，然而在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA鏈即是盤繞在組蛋白周圍形成一種致密的結(jié)構(gòu)。這就是所謂超螺旋結(jié)構(gòu)，由于其結(jié)構(gòu)致密，它在凝膠中的泳動(dòng)速度最快。

②

線性DNA：

當(dāng)DNA損傷在DNA雙鏈相對(duì)應(yīng)的兩條鏈上同時(shí)產(chǎn)生切口時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)線性質(zhì)粒DNA，這種DNA的泳動(dòng)速率介于超螺旋與切口質(zhì)粒DNA之間。第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月③開環(huán)DNA：

在質(zhì)粒DNA復(fù)制過程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶I會(huì)在DNA雙螺旋中的一條鏈中引入一個(gè)切口，解開質(zhì)粒的超螺旋。在質(zhì)粒分離過程中由于物理剪切和酶的切割作用同樣也會(huì)在超螺旋質(zhì)粒中引入切口從而產(chǎn)生松散的開環(huán)結(jié)構(gòu)。這種形式的質(zhì)粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)。第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率不同。要有效地分離大小不同的DNA片段，需選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度。3）瓊脂糖的濃度第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用。第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)和核酸，由于pH的不同帶有不同電荷，且在電場中受力大小不同，導(dǎo)致發(fā)生泳動(dòng)的速度不同，最終可將其分離開來。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10^7bp的DNA片段。第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳的緩沖液中充滿了離子，因此可以導(dǎo)電。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳注意點(diǎn)選擇合適的電泳方法瓊脂糖凝膠電泳：一般的核酸檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳：高分辨率脈沖凝膠電泳：DNA鏈巨大凝膠濃度濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用于大片段核酸的電泳，高濃度的用于小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意：高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月緩沖液:常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月電壓和溫度:

電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。

注意：如果電泳時(shí)電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA電泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正對(duì)照DNA來估計(jì)DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)比較準(zhǔn)確。需要注意的是Marker的電泳同樣要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸染色劑

實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB）

溴化乙錠（EB）：是一種吖啶類染料，它在紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射檢測瓊脂糖中的DNA優(yōu)點(diǎn)：染色效果好，操作