分子熒光分析法實驗

關于分子熒光分析法實驗第1頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月一、分子熒光分析法簡介(對光的吸收)第2頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1熒光的產(chǎn)生

當被測物質(zhì)受到光照后，被測物分子吸收了具有特征頻率的輻射能，分子從基態(tài)上升到激發(fā)態(tài)，分子在較高能級的激發(fā)態(tài)時，它可能處于激發(fā)態(tài)中各種振動狀態(tài)的一種。然而由于分子通過與溶劑分子，同類分子或其他分子的碰撞，而失去振動能級，降低至激發(fā)態(tài)時的最低振動能級，在此過程中并不發(fā)光。但當分子從激發(fā)態(tài)的最低振動能級，即第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降落至基態(tài)的各個不同的振動能級時，則以光的形式輻射出能量，所輻射出的光即是熒光。第3頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)生激發(fā)態(tài)反應分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程1.1熒光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉化的形式和速率：A1,A2吸收:10-15sVR振動松弛：10-12sic內(nèi)轉化：10-11sisc系間竄越：

10-6

~10-2sF熒光：10-9~10-6sP磷光：10-6~100s第4頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.2熒光光譜當固定激發(fā)光波長和強度不變，而記錄熒光強度隨波長變化的曲線，稱為熒光光譜。若固定熒光最強處的熒光波長不變而改變激發(fā)光波長，記錄熒光強度隨激發(fā)光波長變化的曲線，稱為激發(fā)光譜。第5頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月激發(fā)光譜發(fā)射光譜1.2熒光光譜

任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。組成、結構與衍化信息☆物質(zhì)的化學結構☆環(huán)境與介質(zhì)條件☆與其它溶質(zhì)的相互作用☆反應動力學第6頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3熒光定量F=K﹒I0﹒φf﹒CI0：光源強度；φf：熒光量子產(chǎn)率；C：熒光體濃度）試比較熒光法與紫外-可見分光光度法的分析性能。?問題：（☆注意：在一定濃度范圍內(nèi)適用）第8頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4熒光儀的基本構造？問題：熒光光度計與紫外-可見分光光度計在光路設置上有什么不同？為什么？第9頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.5分子熒光分析法的應用簡介★常規(guī)分析應用：

☆定性分析：φf；λex；λem；峰形等

☆定量檢測：

F=K﹒I0﹒φf﹒C

☆其它（略）★高端生化研究：

☆分子相互作用研究；☆代謝動力學跟蹤；☆顯微成像（物理遷移與化學衍化的原位“顯跡”）第10頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月二、維生素B2含量的熒光法測定2.1實驗原理

維生素Ｂ２（核黃素）在一定波長的激發(fā)光照射下會發(fā)射出綠色熒光，根據(jù)熒光強度在一定濃度范圍內(nèi)與熒光物質(zhì)濃度成正比，用標準曲線法對樣品進行定量分析，在線性良好的情況下，也可用濃度直接讀出被測樣品的濃度。

第11頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月2.2實驗流程1、VB2的熒光光譜的繪制2、標準工作曲線的制作3、未知液的測定第12頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月1.開機：打開RF-5301熒光分光光度計的電源開關，打印機開關，開啟電腦。預熱儀器20分鐘。2.配制系列維生素Ｂ２標準溶液：取5個干凈的50ml容量瓶，分別加入1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml濃度為10.0μg/ml的維生素Ｂ２標準溶液用水稀釋至刻度，搖勻。3.儀器自檢：預熱儀器20分鐘后，雙擊電腦桌面上“RF-530XPC”圖標，儀器在計算機的引導下開始自檢，約3分鐘完畢，此時儀器操作軟件打開。若此時軟件為“光譜測定”模式，則點擊“AcquireMode”主菜單，在下拉菜單中選擇“Quantitative”，此時軟件轉為“定量測定”界面模式。第13頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月4.參數(shù)設定：“定量測定”界面模式下，點擊“Configure”主菜單，在下拉菜單中選擇“Parameters”菜單，則會自動彈出“Quantitative

Parameters”窗口，在此窗口中，需要設置以下五個參數(shù)：在“EXWavelength”中填270，在“EMWavelength”中填525，在“SlitWidth[nm]EX”中填10，在“SlitWidth[nm]EM”中填10，在“Sensitivity:HighLow”中選Low，其他參數(shù)選默認值，不要調(diào)整它們，參數(shù)設置好后，按“OK”此時軟件自動回到“定量測定”界面模式。此時儀器參數(shù)設置完畢。第14頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月5.空白溶液測試：設置好儀器的工作條件后，把裝有去離子水的樣品池置于試樣架內(nèi)，在熒光光路上插入ＵＶ－35濾光片，合上樣品室蓋子，在計算機屏幕上點擊“AUTOZERO”，觀察屏幕右下腳的基線值接近零時，再點擊“READ”讀數(shù)，得空白溶液數(shù)值。6.系列維生素Ｂ２標準溶液的測試：把各標準樣品按從稀到濃的順序置于試樣架內(nèi)，和空白溶液測試方法相同，分別測定不同濃度標準溶液的相對熒光強度。7.未知試樣的測定：將已配制處理好的未知試樣裝入樣品池置于試樣架內(nèi)，用測定標準溶液相同的條件，測其相對熒光強度。8.關機：先關計算機，再關儀器，打印機；清洗樣品池，容量瓶等玻璃儀器，整理好儀器。第15頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月2.3注意事項：☆系列標液的測定順序☆即放即測，防光降解☆熒光儀的開關機順序第16頁，課件共18頁，創(chuàng)作于2023年2月2