蛋白質(zhì)純化技術(shù)

蛋白質(zhì)的分離純化與鑒定Isolation,PurificationandIdentificationofProtein2021/5/91分子生物學圣經(jīng)—分子克隆實驗指南2021/5/92為什么要純化蛋白質(zhì)？理論意義：深入研究某種蛋白質(zhì)的功能以及作用機制，如信號通路中的蛋白質(zhì)…應用價值蛋白質(zhì)工程醫(yī)藥、工業(yè)、科研…作為藥物靶點…蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者2021/5/93蛋白質(zhì)工程中進行蛋白質(zhì)純化的必要性首先，需要單一的蛋白質(zhì)作為實驗材料，研究其結(jié)構(gòu)與功能；其次，對蛋白質(zhì)進行修飾改造時需要單一的蛋白質(zhì)作為原材料；最后，為了生產(chǎn)性能更優(yōu)良的蛋白質(zhì)，需要對設(shè)計改造過的蛋白質(zhì)進行大量純化，從而開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品。2021/5/94本章概要蛋白質(zhì)純化方法蛋白質(zhì)純化原則純化步驟蛋白質(zhì)的鑒定2021/5/95一、蛋白純化方法蛋白質(zhì)純化的根據(jù)：

不同的蛋白質(zhì)，理化性質(zhì)不同。理化性質(zhì)不同的原因：

氨基酸的數(shù)目和序列不同。2021/5/961.與蛋白質(zhì)分離純化相關(guān)的理化特性①分子大?、诜肿有螤睥蹘щ娞匦寓苋芙馓匦寓菖c配體特異性結(jié)合不同⑥吸附性質(zhì)⑦變性和復性2021/5/971.1分子大小蛋白質(zhì)分子大小主要取決于：

蛋白質(zhì)肽鏈的數(shù)目

每條肽鏈的氨基酸殘基數(shù)目。幾百~百萬Da常用方法透析超濾凝膠過濾離心2021/5/98

透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。2021/5/992021/5/910

超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。2021/5/911

超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。2021/5/912凝膠過濾是按照天然蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進行分離的技術(shù)，又稱為分子篩層析或排阻層析。2021/5/9132021/5/914超速離心離心（centrifugation）：利用機械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開來的方法。超速離心法(ultracentrifugation)：~60萬g，6萬~8萬r/min?？捎脕頊y定蛋白質(zhì)分子量。2021/5/915超速離心2021/5/9161.2分子形狀形狀蛋白質(zhì)在離心通過溶液時，或通過膜、凝膠過濾填料顆?；螂娪灸z中時，都會受到分子形狀的影響。方法梯度離心電泳2021/5/9171.3電荷原理蛋白質(zhì)的凈電荷與蛋白質(zhì)等電點pI以及環(huán)境pH值有關(guān)（pH>pI，－）方法電泳離子交換層析2021/5/9182021/5/9191.4溶解度原理蛋白質(zhì)分子表面親水性和疏水性帶電基團不同，因此在溶劑中的溶解度不同。通過改變pH、離子強度或加入有機試劑，促進蛋白質(zhì)分子的凝聚進而形成沉淀。方法：沉淀法鹽析法（eg.硫酸銨）有機溶劑沉淀法（eg.丙酮）等電點沉淀法2021/5/920蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，稱為鹽析。鹽析原理：高濃度鹽離子破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜，影響蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。鹽析法2021/5/9211.5配體特異性結(jié)合原理生物大分子的某些特定結(jié)構(gòu)區(qū)域能夠特異性識別其他分子并可逆結(jié)合，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。方法將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性對另一個分子進行分離純化。分類免疫親和層析生物親和層析金屬螯合親和層析2021/5/9221.6吸附性質(zhì)原理

蛋白質(zhì)可吸附在不同材料的表面，如金屬、陶瓷、塑料等。方法疏水層析2021/5/9231.7變性和復性原理變性：蛋白質(zhì)在一定的理化條件下會失去原有的空間結(jié)構(gòu)、生物學功能及部分理化特性。復性：當變性條件去除后恢復原有的空間結(jié)構(gòu)及生物學功能。方法如，利用尿素的變性和復性方法，從包涵體中純化原核表達蛋白2021/5/9242.分離方法在實驗操作上，分為：沉淀法離心法電泳法超濾法相分配法層析法2021/5/9252021/5/926*不可能有一套統(tǒng)一的方法適用于分離純化所有的蛋白質(zhì)，*但每一種蛋白質(zhì)可能都有一套適合的分離純化程序，*而且所用的主要技術(shù)手段都基本相同。Note2021/5/927二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟總原則以合理的效率、速度、收率和純度，將目標蛋白從細胞的全部其他成分，特別是從雜蛋白中分離出來，同時仍保留其生物學活性和化學完整性。2021/5/928二、蛋白質(zhì)純化的總原則和純化步驟步驟選擇實驗材料，實驗材料預處理蛋白質(zhì)的提取蛋白質(zhì)的粗分級蛋白質(zhì)的細分級蛋白質(zhì)的鑒定2021/5/929蛋白質(zhì)純化的前期準備關(guān)于蛋白質(zhì)我們已知什么？最好的來源？蛋白質(zhì)純度要求？活性要求？純化蛋白的量？如何進行鑒定？純化時間長短？最終花費？純化方案？2021/5/9301、選擇實驗材料及預處理選擇實驗材料物種的選擇組織的選擇實驗材料預處理液體材料過濾離心固體材料洗滌：自來水—蒸餾水—提取緩沖液材料破碎：2021/5/931材料破碎機械剪碎研磨反復凍融法超聲破碎法高壓勻漿法酶解法2021/5/9322、蛋白質(zhì)的提?、偬崛》蛛x原則盡可能多地提取目的蛋白，同時避免活性丟失（溫度過高、pH、有機試劑、金屬離子、蛋白酶等因素）選擇合適的pH、選擇合適的離子強度2021/5/9332、蛋白質(zhì)的提取②提取液成分的確定pH緩沖液：Tris-HCl,Tris-Gly,Gly-HCl,檸檬酸-檸檬酸鈉…離子：動物NaCl,植物KCl還原劑:DTT…蛋白酶抑制劑：EDTA,PMSF…金屬離子螯合劑:EDTA,EGTA…去污劑:SDS,CHAPS,TritonX-100,Tween-20甘油③溫度0~4℃2021/5/9343、蛋白質(zhì)的粗分級（粗提）使用蛋白質(zhì)提取緩沖液提取實驗材料后，蛋白提取液中目標蛋白質(zhì)的濃度往往較低，采取一些簡單的方法使目標蛋白質(zhì)濃縮，同時去除大量的雜質(zhì)。常用的實驗技術(shù)：沉淀法（鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀）、超速離心、透析、超濾…2021/5/9354、蛋白質(zhì)的細分級粗分級只是使蛋白質(zhì)得到濃縮和初步分離純化，多數(shù)情況下還要根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、分子形狀、分子表面特征或分子帶電狀況進一步純化。常用的實驗技術(shù)：層析2021/5/9364.1.層析（chromatography）固定相：凝膠流動相：緩沖液原理：2021/5/937凝膠介質(zhì)PharmaciaBioGelAagaroseBioGelPacrylamideBio-RadSephadexglucose(dextrose)SepharoseagaroseSephacrylglucose+acrylamideSephacelcellulose2021/5/938層析裝置（Chromatographicequipment）蠕動泵層析柱檢測器記錄儀部分收集器2021/5/939①②③2021/5/9402021/5/9414.1.層析（chromatography）分子篩層析（Gelfiltration）離子交換層析（Ionexchange）疏水作用層析（Hydrophobicinteraction）親和層析（Affinity）2021/5/9424.1.1分子篩層析（Gelfiltration）原理也稱為凝膠過濾、排阻層析。是以多孔凝膠材料為支持物，當?shù)鞍踪|(zhì)溶液流經(jīng)此支持物時，分子大小不同的蛋白質(zhì)所受到的阻滯作用不同而先后流出，從而達到分離純化的目的。凝膠介質(zhì)葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）2021/5/943分子篩層析

GelfiltrationchromatographyHydrophilicNospontaneousbindingtoproteins.ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow-rate親水對蛋白質(zhì)親和力低物理化學性質(zhì)穩(wěn)定流速穩(wěn)定2021/5/944分子篩層析

Gelfiltrationchromatography2021/5/945分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>2021/5/946分子篩層析

Gelfiltrationchromatography>>2021/5/9474.1.2離子交換層析（Ionexchange）原理在一定的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)帶有的電荷的種類和數(shù)量不同，因此它們與帶電的凝膠顆粒間的電荷相互作用不同。利用蛋白質(zhì)和帶電凝膠之間作用力的差別，把蛋白質(zhì)分開的層析方法。2021/5/9484.1.2離子交換層析（Ionexchange）種類陽離子交換柱：凝膠帶負電荷，蛋白質(zhì)帶正電荷陰離子交換柱：凝膠帶正電荷，蛋白質(zhì)帶負電荷介質(zhì)惰性支持物：瓊脂糖，葡聚糖…帶電基團：羧甲基—帶負電；二乙基氨基—帶正電平衡離子：

負電基團：H+或Na+

正電基團：OH-或Cl-2021/5/949離子交換層析（Ionexchange）陽離子交換：陰離子先，陽離子后陰離子交換：陽離子先，陰離子后2021/5/9504.1.3親和層析（Affinitychromatography）原理利用蛋白質(zhì)與配體專一性識別并結(jié)合的特性而分離蛋白質(zhì)的一種層析方法。將配體固定于支持物上，當混合樣品流過此支持物時，只有目標蛋白能與配體專一性結(jié)合。先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后改變洗脫條件，將目標蛋白洗脫下來。2021/5/951親和層析（Affinitychromatography）2021/5/952His-親合示意圖（金屬螯合層析）固相載體鎳柱（Ni-NTA）PETexpressionsystem2021/5/9534.1.4疏水作用層析原理蛋白質(zhì)表面疏水基團與介質(zhì)疏水配體的可逆相互作用方法高離子強度下待分離的樣品吸附在疏水介質(zhì)上，然后降低離子強度選擇性將樣品解吸，疏水弱的物質(zhì)先洗脫，疏水強的物質(zhì)后洗脫。2021/5/9544.2.電泳（Electrophoresis）電泳就是帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動。2021/5/955蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）2021/5/9564.2.1SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS：1、覆蓋蛋白質(zhì)表面電荷，消除電荷差異2、改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象，消除形狀差異2021/5/957電泳法測目標蛋白的分子量2021/5/9584.2.2不連續(xù)PAGE分離蛋白質(zhì)的原理在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，所帶電荷、分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)在凝膠中能夠被分離。原理電荷效應濃縮效應快慢離子效應凝膠濃度差效應分子篩效應2021/5/9594.2.3等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing—IEF）2021/5/960等電聚焦（Isoelectricfocusing）2021/5/9614.2.4雙向電泳第一向：等電聚焦（pI）第二向：SDS(MW)雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實驗技術(shù)之一。2021/5/962①Isoelectricfocusing②SDSgelelectrophoresis2021/5/963TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized2021/5/964蛋白質(zhì)純化策略方案設(shè)計篇

Proteinpurificationstrategy2021/5/965三、純化方案設(shè)計原則確定純化目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically2021/5/966確定純化目標2021/5/967三、純化方案設(shè)計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically2021/5/968三、純化方案設(shè)計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically2021/5/969嚴格依據(jù)目標蛋白質(zhì)的特殊生物學性質(zhì)，來設(shè)計活性檢測方案常見檢測方法:酶學檢測enzymaticassays.配體檢測ligand-bindingassays免疫檢測immunologicalassays活性測定方法的要求：快速、簡便、特異和定量確定活性檢測方法2021/5/970三、純化方案設(shè)計原則確定目標purity,activityandquantity充分了解目的蛋白及主要雜質(zhì)的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimisation確定活性測定方法fastdetectionofproteinactivity/recoveryandcriticalcontaminants盡量減少純化步驟extrastepsreduceyieldandincreasetime,combinestepslogically2021/5/971盡量減少純化步驟純化步驟越多，樣品損失越大（產(chǎn)量、活性）2021/5/972減少每步操作時間toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery減少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物（如蛋白酶）forexample,proteases每步使用不同的純化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparation(size,charge,hydrophobicity,ligandspecificity)KEEPITSIMPLE!盡量減少純化步驟2021/5/973四、蛋白質(zhì)的鑒定1.濃度測定：凱氏定氮法、紫外吸收法…2.純度測定：電泳法…3.特性測定：