臨床免疫測定技術(shù)

臨床免疫測定技術(shù)臨床免疫測定技術(shù)第1頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!凝集試驗WidalreactionWeil-felixreactionWrighttest:布魯菌病交叉配血試驗臨床免疫測定技術(shù)第2頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑能夠訪問Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個供公共檢索抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)起源于全球范圍研究機構(gòu)與商業(yè)企業(yè)。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評價數(shù)據(jù)庫兩個別組成，以幫助研究者更高效尋找并評定該抗體性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜應(yīng)用型檢索平臺需要相關(guān)試驗室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診療試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息，能夠訪問探生網(wǎng)biomean進行咨詢，期待您加入臨床免疫測定技術(shù)第3頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!Widalreaction（試管內(nèi)凝集反應(yīng)）?。海?：10）待檢血清3.0ml

生理鹽水

3.0ml/管

釋度1:201:401:801:1601:3201:640

臨床免疫測定技術(shù)第4頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

待測血清抗體效價（滴度）：即出現(xiàn)“++”凝集最終血清稀釋度臨床免疫測定技術(shù)第5頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!血型判定（玻片凝集反應(yīng)）（直接）YYY+抗A標(biāo)準(zhǔn)血清YYY+抗B標(biāo)準(zhǔn)血清

待測RBC待測RBCA型B型臨床免疫測定技術(shù)第6頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

乳膠凝集試驗(間接)帶現(xiàn)象Zonephenomenon前帶prezone后帶postzone臨床免疫測定技術(shù)第7頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!臨床免疫測定技術(shù)第8頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!1）正向間接凝集試驗

(用抗原致敏載體--檢測Ab)2）反向間接凝集試驗間接凝集—(用抗體致敏載體----檢測Ag）

3）間接凝集抑制試驗

4)協(xié)同凝集試驗

(SPA抗體致敏------測抗原)臨床免疫測定技術(shù)第9頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

反向間接血凝試驗(測Ag)1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512<232128324Patient12345678臨床免疫測定技術(shù)第10頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!抗球蛋白抗體試驗-commbs

（抗RBC不完全抗體）A（間接法—游離）B（直接法—結(jié)合）：臨床免疫測定技術(shù)第11頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!(Influidphase)

絮狀沉淀試驗：AgAb環(huán)狀沉淀試驗臨床免疫測定技術(shù)第12頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!(Ingelphase)

singlegeldiffusiontest

抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線操作：抗體混于凝膠中

抗原加入孔內(nèi)抗原自由擴散測定沉淀環(huán)直徑在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)抗原濃度臨床免疫測定技術(shù)第13頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!影響原因:1.抗原分子量：與擴散速度、沉淀環(huán)反相關(guān)2.抗體種類：兔抗血清優(yōu)于馬、羊3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小4.擴散時間：抗原含量高，擴散時間長5.擴散溫度：4～37℃內(nèi)溫度與擴散速度正相關(guān)6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關(guān)臨床免疫測定技術(shù)第14頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!doublegeldiffusiontest原理:將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板對應(yīng)孔中，二者各自在凝膠中向四面自由擴散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在百分比適當(dāng)時形成沉淀線。臨床免疫測定技術(shù)第15頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!瓊脂雙向擴散試驗應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體2.抗原性質(zhì)分析3.抗體效價滴定4.抗原或抗體純度判定臨床免疫測定技術(shù)第16頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

1.檢測未知抗原或抗體

臨床免疫測定技術(shù)第17頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!A:濃度Ag、Ab及擴散率近似；B：濃度Ag、Ab近似，擴散率Ag＞Ab；C：濃度Ag、Ab近似，擴散率Ag＜AbD：濃度Ag＞Ab，擴散率近似；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab；臨床免疫測定技術(shù)第18頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!2.抗原性質(zhì)分析臨床免疫測定技術(shù)第19頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!3.抗體效價滴定

臨床免疫測定技術(shù)第20頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

4.抗原或抗體純度判定臨床免疫測定技術(shù)第21頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!免疫濁度試驗(略)免疫球蛋白檢測（簡）臨床免疫測定技術(shù)第22頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!年齡IgGIgAIgM臍血6.5～16.00.01～0.04＜0.251月2.5～9.00.02～0.50.20～0.82～9月2.0～9.00.04～0.80.25～1.010～12月2.9～10.70.15～0.90.35～1.51～5歲3.4～12.40.15～1.60.45～2.06～12歲6.5～16.00.35～2.50.50～2.512～60歲6.5～16.00.40～3.50.50～3.0

健康人血清Ig含量（g/L）臨床免疫測定技術(shù)第23頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

免疫固定電泳（測M蛋白）臨床免疫測定技術(shù)第24頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!CH50(complementhemolysis50%).原理：組分和功效完整補體系統(tǒng)能使抗體致敏羊紅細胞（SRBC）發(fā)生溶血反應(yīng)。在一定范圍內(nèi)，SRBC溶血程度與補體總活性成正相關(guān)。以溶血百分率作縱坐標(biāo)，對應(yīng)血清量為橫坐標(biāo)繪圖，在一個適當(dāng)、穩(wěn)定反應(yīng)體系中，溶血程度與補體劑量依賴呈一個S形曲線臨床免疫測定技術(shù)第25頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!Enzymelinkedimmunosorbentassay

（ELISA）原理（Principle）：將抗原或抗體結(jié)合到某固相載體表面，保持其免疫活性，測定時,把被測sample和conjugate按不一樣步驟與固相載體上immunosorbent反應(yīng)。用洗滌方法使與固相載體上形成immunocomplex與其他物質(zhì)分開，再加入酶反應(yīng)substrate，經(jīng)酶催化作用后substrate變?yōu)橛猩a(chǎn)物。產(chǎn)物量與標(biāo)本中被檢物量直接相關(guān)。臨床免疫測定技術(shù)第26頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!ELISA操作基礎(chǔ)步驟：標(biāo)本搜集、運輸和保留試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷結(jié)果匯報及解釋臨床免疫測定技術(shù)第27頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

1、標(biāo)本搜集、運輸和保留

ELISA檢測分析用標(biāo)本—血清（漿）特殊項目用：唾液、腦脊液、尿液、糞便等ELISA檢測分析對象—病原體抗原/抗體

Tumormark、hormone、cytokineetal采集、運輸與保留注意點：采集時間、運輸條件、暫存點溫度臨床免疫測定技術(shù)第28頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!可能影響測定結(jié)果標(biāo)本原因一、內(nèi)源性（標(biāo)本內(nèi)）類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor）補體（complement）異嗜性抗體（heterophilicantibody）治療或診療用鼠抗體（抗鼠抗體）本身抗體或溶菌酶等二、外源性（操作）溶血、重復(fù)凍融細菌污染儲存時間過長標(biāo)本凝固不全臨床免疫測定技術(shù)第29頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!對策：

1、稀釋標(biāo)本

2、改變選取酶標(biāo)抗體

3、預(yù)封閉（變性IgG）

4、加入一些還原劑

5、血清標(biāo)本補體滅活（56℃30min）

6、選擇包被或標(biāo)識抗體～如F(ab)2片段

7、用理化方法解離本身抗體

8、標(biāo)本中添加Cu2+離子或卵白蛋白等等臨床免疫測定技術(shù)第30頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

2、試劑準(zhǔn)備

1、試驗開始前，將試劑盒從冰箱取出置室溫放置20min以上啟用，謂平衡（balance）目標(biāo)：

1）確保反應(yīng)溫度一致性

2）去濕化，確保試劑濃度2、稀釋液質(zhì)量和特殊試劑配制要求臨床免疫測定技術(shù)第31頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!3、加樣

標(biāo)準(zhǔn)：量準(zhǔn)操作規(guī)范量準(zhǔn)—移液槍狀態(tài)與正確使用操作規(guī)范—①正確使用加樣器臨床免疫測定技術(shù)第32頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!3、加樣操作規(guī)范—②掌握操作要領(lǐng)吸頭與加樣器上吸頭套密閉吸頭進入液體深度要適宜放送液體注意角度（10～40°）位置（下1/3）速度（不宜太快）③關(guān)注加樣器狀態(tài)臨床免疫測定技術(shù)第33頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!臨床免疫測定技術(shù)第34頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!4、溫育（incubation）溫育是ELISA檢測反應(yīng)中可能影響其檢測結(jié)果最為關(guān)鍵一個原因。液相待測抗原/抗體與固相抗體/抗原反應(yīng)需要一定溫度與時間，以確保結(jié)合反應(yīng)充分。溫育所需要時間與反應(yīng)溫度成反比。溫育溫度：37℃、室溫、43℃和2～8℃防止“邊緣效應(yīng)”。臨床免疫測定技術(shù)第35頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!5、洗板（washing）經(jīng)過洗滌將特異性結(jié)合與固相抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中可能非特異吸附及游離成份分離，完成固相免疫檢測程序確保測定特異性。洗滌液:0.05%tween-phosphate-buffersalinepH7.4吐溫-20(山梨醇-20)一個非離子去垢劑含親水/疏水基團臨床免疫測定技術(shù)第36頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!在洗滌中作用是經(jīng)過其疏水基團與被動吸附于固相載體上蛋白疏水鍵相互作用以減弱之；同時經(jīng)過其親水基團結(jié)合液相中水分子作用，促使非特異蛋白質(zhì)吸脫。吐溫-20濃度（≤2%）洗滌用量與次數(shù)～臨床免疫測定技術(shù)第37頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!例：選擇4條8孔已包被抗原（HBsAg）ELISA板條每2條分別加同一份弱陽性和陰性樣本然后按試劑盒操作說明加conjugate、溫育洗滌：1排4孔洗1次4排4孔洗4次2排4孔洗2次……………3排4孔洗3次8排4孔洗8次加底物，顯色，比色～評判標(biāo)準(zhǔn)-陽性/陰性值保持最大不變次數(shù)臨床免疫測定技術(shù)第38頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

6、顯色(Colorisappeared)

添加酶特異性底物(HRP-TMB/OPD)確保底物溶液有效性(無色、避光、顯色)反應(yīng)溫度（37℃、室溫）反應(yīng)時間（25～30min）終止反應(yīng)（酸溶液-2mol/Lsulfateacid）及時比色臨床免疫測定技術(shù)第39頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!7、比色(Bytheplatereader)加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻測定時，要注意酶標(biāo)儀波長是否已調(diào)至適當(dāng)比很好酶標(biāo)儀可選擇單波長或雙波長比色測定所謂雙波長比色，即在敏感波長（此時對所顯色具最大光吸收）如450nm和非敏感波長（所測得光吸收為微孔板上劃痕、污跡以及指紋等所致），最終從儀器得到讀數(shù)為在敏感波長測得吸光度與非敏感波長測得吸光度之差。臨床免疫測定技術(shù)第40頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!8、結(jié)果判斷臨床ELISA檢測結(jié)果匯報形式—定性（陰/陽）定量（量值）ELISA定性測定“陰性”和“陽性”判斷依據(jù)是試劑盒所確定陽性判斷值（cut-off）。ELISA定量測定“量值”依據(jù)是試劑盒中所帶標(biāo)準(zhǔn)品同時測定出劑量反應(yīng)曲線（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。cut-off建立(略)S/CO≥1時判為陽性S/N或P/N≥2.1陽性為臨床免疫測定技術(shù)第41頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!“灰區(qū)”（例-HBsAg）臨床免疫測定技術(shù)第42頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

9、結(jié)果匯報及解釋

結(jié)果匯報依據(jù)測定性質(zhì)，定性--陰性/陽性定量--詳細數(shù)值結(jié)果解釋結(jié)合所測項目標(biāo)相關(guān)知識（臨床意義），考慮各種可能影響原因～（關(guān)注測定操作中各步驟，尤其是加樣、溫育和洗滌）臨床免疫測定技術(shù)第43頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!例舉：臨床可能出現(xiàn)問題及原因現(xiàn)象：1、相同標(biāo)本兩次測定結(jié)果不一致原因：加樣/試劑量不準(zhǔn)，板孔間有差異加樣過快，孔間發(fā)生污染加錯樣本加樣/試劑時，落在非包被區(qū)不一樣批號試劑混用溫育、洗滌及反應(yīng)時間不一致孔內(nèi)污染雜物酶標(biāo)儀濾光片不正確血清分離不充分，纖維蛋白原或血細胞入孔臨床免疫測定技術(shù)第44頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!現(xiàn)象：2、弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出原因：溫育時間或溫度不夠，顯色反應(yīng)時間過短，配置緩沖液（洗滌液）蒸餾水有問題現(xiàn)象：3、陽性對照不顯色原因：漏加酶結(jié)合物洗滌液配置？（含有酶抑制物-NaN3）漏加顯色劑，錯加（將終止液誤為顯色液）現(xiàn)象：4、全部孔都有顯色原因：洗滌不夠顯色液變質(zhì)底物或洗滌液被酶污染臨床免疫測定技術(shù)第45頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!

臨床ELISA測定常見模式一、雙抗體夾心檢測抗原二、競爭法檢測抗原三、間接法檢測抗體四、競爭法檢測抗體五、固相捕捉法檢測抗體六、雙抗原夾心檢測抗體七、ABS-ELISA及其它臨床免疫測定技術(shù)第46頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!一、雙抗體夾心檢測抗原例：ELISA雙抗體夾心法定性檢測乙型肝炎表面抗原原理：臨床免疫測定技術(shù)第47頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!Ab＋Ag＋Ab*AbAgAb*＋AbAg＋AgAb*＋Ab*AgAb*abcd臨床免疫測定技術(shù)第48頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!Ab＋AgAbAg（b復(fù)合物）(1)

AbAg＋Ab*AbAgAb*（a復(fù)合物）(2)臨床免疫測定技術(shù)第49頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!HooK‘S效應(yīng)（鉤狀效應(yīng)）臨床免疫測定技術(shù)第50頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!評價：被檢測抗原含有兩個以上抗原決定族（全抗原）標(biāo)本中RF會充當(dāng)抗原分子（干擾）一步法簡便、快捷；存潛在缺點(hook'seffect)

其它-判斷時OD值落在“灰色區(qū)”？假陰性？（hook'seffect/變異）假陽性?

臨床免疫測定技術(shù)第51頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!二、競爭法檢測抗原

例:T3、T4等激素或地高辛、茶堿等藥品濃度檢測臨床免疫測定技術(shù)第52頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!評價：

結(jié)合于固相酶標(biāo)識抗原量與被測抗原量呈反比檢測對象為小分子蛋白（半抗原）檢測中需取得酶標(biāo)識小分子半抗原（制備難）利用于儀器自動化檢測～

臨床免疫測定技術(shù)第53頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!三、間接法檢測抗體例:ELISA間接法檢測各類病原體特異性抗體（IgG）臨床免疫測定技術(shù)第54頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!評價：通用性大。只要更換固相抗原，同一個酶標(biāo)識體體（IgG/IgA、M）可用以各種與抗原對應(yīng)抗體檢測。標(biāo)本高濃度時易受非特異IgG干擾（稀釋）易受其它原因影響（包被抗原純度）

臨床免疫測定技術(shù)第55頁本文由探生科技技術(shù)人員提供,Fantibody全球抗體搜索引擎，您身邊抗體教授!四、競爭法檢測抗體抗體檢測普通不選取競爭法。當(dāng)已知抗原難以純化或抗原/抗體結(jié)合特異性不穩(wěn)定時～實例-ELISA競爭法檢測乙型肝炎病毒關(guān)鍵抗體（基因工程表示HBcAg）固相板（包被HBcAg）+待測標(biāo)本+酶標(biāo)識抗-HBc——