多聚酶鏈式反應(yīng)擴增片斷

關(guān)于多聚酶鏈式反應(yīng)擴增片斷第1頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月★分子生物學(xué)研究中最強大的實驗技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎第2頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月㈠.DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第3頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端3.多脫氧核苷酸鏈得形成多脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖第4頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對，

一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第5頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月㈡.DNA的復(fù)制2.時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期。3.場所細胞核（主要）、線粒體、葉綠體。1.概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程。4.基本條件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四種脫氧核苷酸模板:DNA的兩條鏈第6頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月⑴.邊解旋邊復(fù)制(過程）5.復(fù)制特點⑵.半保留復(fù)制（結(jié)果）6.遵循原則：堿基互補配對原則7.精確復(fù)制的原因8.復(fù)制的意義DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性⑴規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板⑵堿基互補配對能力保證了復(fù)制準確無誤的進行第7頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸第8頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月(二）PCR原理及條件1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_____為模板，在短時間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。多聚酶鏈式反應(yīng)DNA2．DNA的平面結(jié)構(gòu)：AGCT5'端3'端氫鍵ATGC3'端:-OH端5'端:磷酸基團的末端注意：1、DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3‘端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物

2、DNA的合成方向總是從子鏈的5‘端向3‘端延伸第9頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）、DNA

分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃）復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物與兩條單鏈結(jié)合在80~100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。3、PCR原理第10頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性.②當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈.

高溫雖然打開了雙鏈，可會導(dǎo)致酶失活。怎么辦？

第11頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化.3、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用第12頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）、PCR反應(yīng)的條件①DNA模板；②分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四種脫氧核苷酸；④耐高溫的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；⑤控制溫度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的緩沖液中進行。第13頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)1~3步30輪（2）、步驟：變性——復(fù)性——延伸第14頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3′端開始連接脫氧核苷酸

思考：3、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？體外擴增DNA如何提供相似環(huán)境？

變性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高溫）20—30個核苷酸構(gòu)成DNA或RNA第15頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR的比較第16頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶與DNA連接酶的異同第17頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等特點。6

、PCR技術(shù)的特點第18頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備2、循環(huán)過程第19頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第20頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月②復(fù)性（退火）

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合第21頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第22頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第23頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第24頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列第25頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第26頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、循環(huán)特點：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存在于兩個子代DNA分子中③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長1×2N①②第27頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進行DNA的延伸第28頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月3、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量第29頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能嚴格控制溫度變化的溫控設(shè)備第30頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1、PCR儀㈠.設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實驗操作第31頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。第32頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月微量離心管微量移液器第33頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1、準備2、移液（二）實驗操作步驟

按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第34頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢第35頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)②離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果第36頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR三步曲

預(yù)變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復(fù)性55℃30s94℃5min第37頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭第39頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第40頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過程第41頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第42頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月比色杯第43頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的突出優(yōu)點快速高效靈活易于操作四、課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）第44頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月五、實驗小結(jié)PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72℃第45頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月1.提示：繪圖可參考教科書中圖5-9。PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個這樣的片段（2n=230=1073741824)。2.提示：PCR引物是根據(jù)需要擴增的目標DNA的堿基序列來設(shè)計的。引物的設(shè)計需要豐富的分子生物學(xué)實驗經(jīng)驗，感興趣的學(xué)生可以參考《分子克隆實驗指南》（見本專題參考書目），書中有詳盡的論述。書后題第46頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月㈠.理論上DNA擴增數(shù)目的計算三.課題成果評價1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a×2n㈡.實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過程⑴.稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.第47頁，課件共52頁，創(chuàng)作于202