多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段

關(guān)于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增片段第1頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溫故知新1:組成DNA分子的基本單位是什么?這些基本單位是如何連接成DNA分子的?DNA分子結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)？第2頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月12345DNA的基本單位－脫氧核苷酸第3頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖磷酸二酯鍵第4頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ATGCAGCTDNA分子的平面結(jié)構(gòu)氫鍵5'端3'端5'端3'端第5頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子的復(fù)制過(guò)程是怎樣的？DNA分子的復(fù)制需要哪些條件？溫故知新2第6頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA母鏈：提供復(fù)制的模板解旋酶：打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復(fù)制過(guò)程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸DNA復(fù)制的條件第7頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸第8頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過(guò)程當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸一、基礎(chǔ)知識(shí)

（一）PCR原理：第9頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第10頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過(guò)程稱為變性3、PCR原理②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器第11頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月高溫解決了打開雙鏈的問(wèn)題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化4、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用5、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行第13頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出6、PCR技術(shù)的特點(diǎn)第14頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①PCR過(guò)程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為20－30個(gè)脫氧核苷酸7、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn)②PCR過(guò)程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的第15頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制PCR不同點(diǎn)解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80～100℃高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA連接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加溫度體內(nèi)溫和條件高溫子鏈合成一條鏈連續(xù)（先導(dǎo)鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連接（滯后鏈）兩條子鏈均連續(xù)合成相同點(diǎn)①需要提供DNA復(fù)制模板②四種脫氧核苷酸作為原料③子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制與PCR的比較第16頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的原理總結(jié)利用DNA分子的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。第17頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）PCR的反應(yīng)過(guò)程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過(guò)程第18頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性第19頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合第20頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火第21頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈第22頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸第23頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列第24頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第25頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量1

22

43

820

1,048,57630

1,073,741,824第26頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、PCR的反應(yīng)過(guò)程小結(jié)5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/第27頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制55

55

5

5模板DNA55

555

5

5525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)（220）倍以上。第28頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過(guò)程：第29頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR反應(yīng)條件：

①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物④A、T、G、C四種脫氧核苷酸

⑤耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備第30頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次第31頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR儀第32頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微量離心管微量移液器第33頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、準(zhǔn)備2、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑第34頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①過(guò)程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻。A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢。第35頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。①過(guò)程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s。4、離心5、反應(yīng)②離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。第36頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR三步曲預(yù)變性保溫變性94℃30s延伸72℃1min復(fù)性55℃30s94℃5min第37頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min第38頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6、注意事項(xiàng)①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；②PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭第39頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1、原理可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)第40頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月稀釋2μLPCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零測(cè)定取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值計(jì)算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的讀數(shù)）×稀釋倍數(shù)2.過(guò)程第41頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第42頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月比色杯第43頁(yè)，課件共45頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、實(shí)驗(yàn)小結(jié)

PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（