實(shí)習(xí)報(bào)告：動物胚胎移植技術(shù)

動物胚胎移植技術(shù)摘要胚胎移植又稱受精卵移植，是把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮內(nèi)沖洗出來，移植到另一頭雌性動物的輸卵管或是子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)。動物胚胎移植主要是通過對優(yōu)良供體母畜作同期排卵處理和體內(nèi)胚胎生產(chǎn)或體外人工授精（IVF）的方法，以大量獲得優(yōu)良的動物胚胎后再將其移植給普通代孕受體母牛進(jìn)行快速繁殖優(yōu)良動物的生物技術(shù)。胚胎移植技術(shù)主要用于快速擴(kuò)大優(yōu)秀種公牛和核心母牛的數(shù)量。盡管單個(gè)胚胎的生產(chǎn)成本較高，但由于種公牛和種母牛較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值，以及利用胚胎移植在育種方面可以獲得同胞或同卵雙生牛進(jìn)行后裔測定等優(yōu)勢，因此，該技術(shù)在種公牛的選育和優(yōu)質(zhì)核心母牛群的培育以及加快育種步伐方面均具有極大的優(yōu)越性。本論文將對動物胚胎技術(shù)作比較全面的闡述，使大家對動物胚胎技術(shù)有一個(gè)比較全面的認(rèn)識。關(guān)鍵詞：供受體超數(shù)排卵同期發(fā)情胚胎回收胚胎檢查胚胎移植動物胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)發(fā)情后生殖器官的孕向發(fā)育家畜在發(fā)情后生殖器官會發(fā)生一系列變化，如：卵巢中功能性黃體的形成，孕酮的分泌和維持，子宮內(nèi)膜組織的增生和分泌機(jī)能的增強(qiáng)，以及其他生理生化的特異現(xiàn)象。這些變化都為胚胎的生存和發(fā)育創(chuàng)造了適宜的條件，為妊娠作準(zhǔn)備。配種受孕后的動物其生殖系統(tǒng)朝著妊娠的方向繼續(xù)發(fā)生變化以適應(yīng)胚胎發(fā)育的需要，如黃體的持續(xù)存在以及孕酮的分泌和維持，子宮內(nèi)膜的繼續(xù)發(fā)育。而未受孕的動物其生殖系統(tǒng)會退回到發(fā)情前狀態(tài)。發(fā)情供體和受體發(fā)情周期的同期化程度前后不超過一天，否則移植成功率就會降低，甚至移植失敗因此發(fā)情后或交配刺激后雌性動物生殖器官的孕向變化是進(jìn)行胚胎移植的主要生理學(xué)基礎(chǔ)。早期胚胎的游離狀態(tài)胚胎在發(fā)育的早期有相當(dāng)一段時(shí)間是游離存在于子宮內(nèi)的，和子宮黏膜沒有建立緊密聯(lián)系，其發(fā)育主要靠自身貯存的養(yǎng)分。這樣，早期的胚胎容易從生殖道中取出，而且在離體情況下，可短期培養(yǎng)，易存活。早期胚胎處于游離狀態(tài)是能夠進(jìn)行胚胎移植技術(shù)的基礎(chǔ)子宮對早期胚胎的免疫耐受性胚胎遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性在同一物種之內(nèi)進(jìn)行胚胎移植不會產(chǎn)生排斥現(xiàn)象;同時(shí)，受體對胚胎不產(chǎn)生遺傳上的影響，不會改變新個(gè)體的遺傳特性，也不會減弱起優(yōu)良性狀在出生后的表現(xiàn)程度。動物胚胎移植技術(shù)的程序供受體的選擇與管理供體的選擇?遺傳學(xué)價(jià)值在畜牧生產(chǎn)中，應(yīng)選擇生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母獸作為供體?健康狀況應(yīng)選擇身體健康，營養(yǎng)水平中等以上未受孕動物作為供體?繁殖性能供體應(yīng)是達(dá)到配種年齡以上繁殖機(jī)能正常的母畜受體的選擇?身體健康?繁殖狀況正常?母性良好包括泌乳性能和護(hù)仔能力等供受體的管理在供受體選擇時(shí)，可根據(jù)情況進(jìn)行傳染病的檢疫，預(yù)防注射和驅(qū)蟲等工作，確保在胚胎移植過程中供受體的健康;觀察供受體發(fā)情周期，以便超排和同期發(fā)情程序的選擇和安排；每日供給中等以上營養(yǎng)水平，注意青綠飼料，維生素和微量元素的補(bǔ)充；超數(shù)排卵處理在雌性動物發(fā)情周期中的適當(dāng)時(shí)間注射促性腺激素，使卵巢上有比自然生理狀態(tài)下更多的卵泡發(fā)育并排卵，這種方法稱為超數(shù)排卵。其目的是增加有活力卵子的數(shù)量，并獲得較多的可移植胚胎。目前，用于超排的促性腺激素主要是促卵泡素（FSH）和孕馬血清促性腺激素（PMSG）。FSH半衰期短，用于超排時(shí)需要多次注射，而PMSG半衰期長，會產(chǎn)生后效應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)情期延長，影響超排效果和胚胎質(zhì)量，結(jié)合注射PMSG抗血清，可消除半衰期過長的副作用。同期發(fā)情2.3.1同期發(fā)情的定義利用某些激素制劑處理,人為地控制并調(diào)整一群雌性動物發(fā)情周期之間同期化的方法,稱同期發(fā)情.胚胎移植時(shí),受體必須和供體處于相同的發(fā)情階段,才能獲得較高的成功率.在發(fā)情周期的不同階段,生殖器官的內(nèi)分泌環(huán)境,生化和組織學(xué)特性,對不同發(fā)育階段的胚胎有不同的影響,胚胎要移植到和供體處于相同發(fā)情周期階段的受體生殖道的適當(dāng)部位,才能繼續(xù)發(fā)育.同期發(fā)情的原理同期發(fā)情主要借助外源激素刺激卵巢.使之按預(yù)定的要求發(fā)生變化,使處理母畜的卵巢生理機(jī)能處于相同階段.通常采用兩種途徑:一種時(shí)延長黃體期,給一群母畜同時(shí)使用孕激素藥物,抑制卵泡的生長發(fā)育和動物的發(fā)情表現(xiàn).經(jīng)過一定時(shí)期后同時(shí)停藥,由于卵巢同時(shí)失去外源性孕激素的控制,且卵巢上的周期黃體已退化,于是同時(shí)出項(xiàng)卵泡發(fā)育,引起母畜發(fā)情采用孕激素移植母畜發(fā)情,實(shí)際上是認(rèn)為地延長黃體期,起到延長發(fā)情周期,推遲發(fā)情地作用.另一種途徑是縮短黃體期,應(yīng)用前列腺素促使黃體退化,使卵巢提前擺脫內(nèi)源性激素地控制,于是卵泡得以同同時(shí)開始發(fā)育從而達(dá)到母畜同期發(fā)情.這種情況實(shí)際上是縮短母畜地發(fā)情周期,促使母畜在短時(shí)間內(nèi)發(fā)情。同期發(fā)情的藥物及其使用方法抑制卵泡發(fā)育的制劑這一類藥物主要是孕激素類,包括孕酮,甲孕酮,氟孕酮,甲地孕酮和18-甲基炔諾酮等.他們能夠抑制垂體促卵泡素的分泌,延長黃體期,因而間接地抑制卵泡發(fā)育和成熟,是母畜不發(fā)情.其用藥方法有:?陰道栓塞法:將孕酮陰道栓或自制浸吸一定量藥劑的陰道海綿塞放置于陰道前端,藥液不斷被陰道黏膜吸收,經(jīng)過一定時(shí)間后取出,此法常用于牛和羊埋植法:將成形的藥劑或裝有藥物的帶孔容器埋植于母畜皮下組織,藥物被緩慢吸收,經(jīng)過一絲那個(gè)時(shí)間后取出,此法可用作群體處理.注射法:每日將定量藥物作皮下或肌肉注射,經(jīng)過一定時(shí)間后停藥.此法劑量準(zhǔn)確,但操作麻煩.口服法:每日將一定量的藥物均勻拌在飼料中,以單個(gè)飼喂較為準(zhǔn)確,經(jīng)過一定時(shí)間后停藥.這種方法可用于舍飼母畜.但較費(fèi)時(shí)費(fèi)工,群體飼喂還會造成個(gè)體劑量不準(zhǔn)確.溶解黃體的制劑主要是前列腺素及其類似物,如15-甲基PGF2,氯前列烯醇,氯胎素等.它們具有明顯的溶解黃體作用,因此用于正處于黃體期的母畜的同期發(fā)情,對卵巢上沒有黃體的動物無效.牛和羊的發(fā)情周期的7~16d以內(nèi)的黃體對前列腺素都易產(chǎn)生反應(yīng)，采用子宮內(nèi)灌注效果優(yōu)于肌肉注射.經(jīng)前列腺素處理后2~4d,母畜發(fā)現(xiàn)發(fā)情,未發(fā)情的間隔10~20d進(jìn)行第二次注射，在此期間，可能自然發(fā)情形成黃體，對第二次注射作出應(yīng)答反應(yīng).此法方便可靠,但費(fèi)用高。促進(jìn)卵泡發(fā)育，排卵的藥劑主要有FSH,LG,PMSG,hCG和GnRH等及其類似物的那個(gè)，一般在應(yīng)用上述;兩類激素的基礎(chǔ)上配合使用，以增強(qiáng)發(fā)情同期化，并使卵泡更好地成熟和排卵.胚胎回收2.4.1胚胎回收的定義胚胎回收也稱采卵或采胚，就是利用沖胚液把胚胎從供體生殖道中沖洗出來,提供移植或其他胚胎工程應(yīng)用.2.4.2胚胎回收地時(shí)間胚胎回收地時(shí)間,可根據(jù)所需胚胎地發(fā)育階段來確定?動物種類不同,其胚胎早期地發(fā)育速度有所差異.以配種后計(jì)算，幾種動物的早期胚胎發(fā)育進(jìn)程近似值見表*8-2各種家畜軸綁時(shí)間盹胎發(fā)育速度別畜阿時(shí)-2細(xì)電「4嫻固16搐胞進(jìn)人子宮脫離遴明帶附植開始?——打牛51￡:3-2_3U44-3811Q922羊25112-342746S-7tj2-3-li32535_26561.^馬15-3-34-46468兔一--5■-^1_2-24_52-2.4.3沖胚液的配制沖胚液和胚胎的短期培養(yǎng)液通常是用改良的杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)根據(jù)配方要求分別制備1,11,111液,三蒸水加至最終量的80%,在冰箱中冷卻至4°C,依次混合后用容量瓶定容至lOOOmL,注意防止沉淀,PH應(yīng)為7.1~7.2,如不符，可用NaHCO3或HCL調(diào)節(jié)，滲透壓為310m0sm.配好后，用孔徑0.45um濾器過濾除菌，分裝密封(注意無菌操作)，標(biāo)記,4C冰箱保存3~4月.臨用前加入滅活小牛血清,一般沖胚液加10%~20%,也可在定容時(shí)加入血清，然后再過濾分裝.采胚方法根據(jù)動物種類和胚胎的發(fā)育階段,胚胎回收可采用手術(shù)法和非手術(shù)法手術(shù)法就是對供體進(jìn)行常規(guī)腹部手術(shù)將生殖道部分移出腹腔,用沖胚液對輸卵管或子宮角進(jìn)行沖洗,回收胚胎.本法適用于羊,豬和兔等中小動物;在牛中,如需回收進(jìn)入子宮前的早期胚胎,仍需用此法.按外科手術(shù)常規(guī)方法打開腹腔,先把一側(cè)子宮角,輸卵管和卵巢牽引至腹壁切口之外,檢查卵巢反應(yīng)情況（黃體數(shù),殘留卵泡的大小,數(shù)目及排卵情況）并進(jìn)行記錄.沖胚的方法包括輸卵管沖胚法和子宮角沖胚法輸卵管沖胚法用沖胚液沖洗輸卵管腔,回收進(jìn)入子宮前的胚胎,分上行法和下行法.上行法時(shí)從子宮角的前端刺入注射針,向上沖洗輸卵管,注意用手指固定針頭并提捏住子宮角,防止沖洗液從進(jìn)針周圍流出后流向子宮體方向.沖洗液通過從輸卵管傘插入到壺腹部的玻璃細(xì)管或硅膠管等回收到平皿或試管內(nèi);下行法時(shí)通過從傘部插入到壺腹的玻璃細(xì)管或硅膠管等注入沖胚液,向子宮方向沖洗,沖洗液通過插入到子宮角上部的帶有充氣囊的二路式導(dǎo)管或回收針回收.一側(cè)沖洗完畢后,還納腹腔,在沖另一側(cè).子宮角沖胚法沖洗子宮角，回收進(jìn)入子宮角的胚胎?依據(jù)動物子宮角的大小,選用長4~5cm,外徑1.2~1.4mm的針頭,改制一個(gè)回收針.將回收針插入子宮腔,用套有乳膠管的腸鉗夾住子宮角和針體?將宮管結(jié)合部之前的輸卵管用血管夾夾住，以免沖胚液流入輸卵管?然后從宮管結(jié)合部后端的膠管收集沖出液于平皿或試管內(nèi)?一側(cè)沖洗完畢后，除去器械，確認(rèn)針孔無出血后，還納腹腔，然后沖另一側(cè).

沖胚完畢后，把生殖器官還納腹腔，向腹腔注入防粘連劑和抗生素.按常規(guī)腹部手術(shù)方法閉合手術(shù)通路,進(jìn)行常規(guī)術(shù)后護(hù)理.手術(shù)法采胚,沖胚液用量少，胚胎回收率高,但由于手術(shù)對動物有一定的損傷,手術(shù)不當(dāng)或多次手術(shù)，易引起生殖器官粘連，導(dǎo)致供體不孕.B圖S-2手術(shù)沖卵示意圖A.輸卵管向傘部沖洗B.由輸卵管向子官角沖洗2?4?4?2非手術(shù)法是在胚胎進(jìn)入子宮角后，用沖胚器具通過子宮角沖洗采集胚胎的方法?可以不做手術(shù)而采胚，不僅減小了手術(shù)對供體的危害，節(jié)約時(shí)間，降低成本，而且可以重復(fù)采胚.本法主要用于牛,馬等大家畜.回收方法：先要去除子宮頸黏液，術(shù)者一手在直腸內(nèi)握住子宮頸，一手持子宮頸黏液去除器插入子宮頸，由助手抽吸除去子宮頸黏液.如插入困難，可用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，除去子宮頸黏液后，送入兩路或三路沖胚管?沖胚管前端插入子宮角前1/3后，給氣囊充氣。通過沖胚管的進(jìn)液管向子宮內(nèi)注入沖胚液?當(dāng)液體注入使子宮角膨大到相當(dāng)于妊娠40?60d時(shí)，一般20?40ml，如使用三路沖胚管，可打開除夜管，并按摩子宮，時(shí)胚胎從子宮皺壁中游離出來，隨液體流出，收集在量筒活集卵胚等容器內(nèi)。反復(fù)沖洗，每側(cè)用液300?500ml。沖洗完畢，向子宮內(nèi)注入青霉素100萬IU,鏈霉素1.0g?；厥盏臎_胚液，在室溫下靜置30min，用吸管除去上部液體，將下部回收液放入大檢卵杯活平皿中檢出胚胎，也可用集卵杯過濾沖胚液，剩下適量用于檢胚。K-3牛彳牡于-術(shù)沖卵示態(tài)禺產(chǎn)肖佝放人?顯示葉資何飩2.5胚胎檢査2.5.1胚胎檢査的定義胚檢是從回收液中，將受精卵活胚胎檢出，并進(jìn)行必要的凈化處理，同時(shí)對檢得的胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確定其品質(zhì)，把符合移植的胚胎暫時(shí)保存于新鮮培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備移植或保存。2.5.2胚胎的發(fā)育受精后，卵細(xì)胞是按2,4,8…….細(xì)胞順序相繼分裂，到16細(xì)胞為止，可通過顯微鏡觀察來計(jì)算分裂球的數(shù)目。16細(xì)胞以后，分裂球難以計(jì)算，形成的細(xì)胞團(tuán)呈桑椹狀，故稱為桑椹胚。桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，在細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)小腔，形成囊胚狀，這時(shí)的胚胎叫囊胚。囊胚逐漸擴(kuò)張其腔，不久從透明帶中脫出（即孵化）。正常的胚胎透明帶應(yīng)是圓形，有彈性，厚度隨著胚胎的發(fā)育而變化，胚胎細(xì)胞發(fā)育均勻一致，輪廓清晰規(guī)則。凡出現(xiàn)邊緣不整齊，細(xì)胞突出，色暗及有空泡和游離分裂球的為異常胚胎。胚胎質(zhì)量的形態(tài)學(xué)評級與分級超排處理后，卵巢內(nèi)的卵泡并非同時(shí)排卵，加之超排處理使生殖道的內(nèi)分泌環(huán)境發(fā)生改變，回收到的胚胎發(fā)育程度有很大的變化。這就需要對胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，選出形態(tài)比較正常的胚胎進(jìn)行移植或保存。有些形態(tài)特征較差或發(fā)育遲緩的胚胎移植后也有可能發(fā)育，但發(fā)育延遲2天以上者，往往難以存活。胚胎質(zhì)量的形態(tài)評價(jià)可在40?200倍的顯微鏡下觀察，評價(jià)的主要內(nèi)容有：1透明帶的形態(tài)和完整性。2胚胎的發(fā)育階段與胚齡是否一致。3胚胎的形態(tài)與勻稱性，胚內(nèi)細(xì)胞大小的變化。4細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色，胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡，細(xì)胞碎片，有無游離細(xì)胞根據(jù)胚胎的形態(tài)特征，可將胚胎分為三個(gè)等級：A級：為優(yōu)良胚胎，齊形態(tài)典型，卵裂球輪廓清晰，緊密充實(shí)，細(xì)胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布均一。B級：為普通胚胎，與A級胚胎相比，稍有變形，但卵裂球的輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)較致密，分布均勻，變形細(xì)胞和空泡不超過30％。C級：為不良胚胎，其形態(tài)有明顯變異，卵裂球輪廓稍有不清晰或部分不清晰，大小不一，細(xì)胞質(zhì)不致密，分布不均勻，色調(diào)發(fā)暗，突出的細(xì)胞，空泡和變形的細(xì)胞占30％?50％。2.6胚胎的移植胚胎移植的定義胚胎的移植就是把胚胎在放入受體的生殖道的適當(dāng)部位，使其繼續(xù)發(fā)育為胎兒，是整個(gè)胚胎移植技術(shù)的關(guān)鍵一環(huán)。胚胎移植的方法常規(guī)手術(shù)移植對受體進(jìn)行腹部手術(shù)，取出子宮和輸卵管，風(fēng)巨胚胎發(fā)育情況，將胚胎移入輸卵管或子宮角，適用于羊、豬、兔等中小動物。移胚管有玻璃細(xì)管、塑料管帶塑料套管的針管等，接1ml注射液，吸入新鮮DPBS三段與管中，中段含胚胎。輸卵管移植時(shí)，將移胚管經(jīng)傘部腹腔孔插入輸卵管2?3cm；注入胚胎；子宮角移植時(shí)，在黃體側(cè)子宮角前1/3先用鈍針將子宮角開洞，在插入移胚管，確認(rèn)在子宮角腔內(nèi)注入胚胎。移植時(shí)要避免注入空氣，抽出移胚管時(shí)要慢，防止將胚胎帶出。對移植情況進(jìn)行記錄。簡易手術(shù)移植郭志勤（1998）把我國船頭豬的小挑去勢技術(shù)用于綿羊、山羊的胚胎移植上，手術(shù)時(shí)間由常規(guī)的20?30min降為1?3min,粘連率降至5%左右，且減少感染,不易出血。用豬的小挑手術(shù)刀，在麻醉后受體羊大腿內(nèi)側(cè)鼠蹊部（無毛處），經(jīng)消毒后，將皮膚向腹部拉緊，用手術(shù)刀在靠近盆腔處下刀，開約1.2?1.5cm可通入腹腔的道刀口，插入食指，指到子宮后在插入刀柄，用食指和刀柄夾出子宮角，進(jìn)行移植。術(shù)后還納子宮角，松開皮膚，使腹腔的切口由復(fù)原皮膚錯(cuò)開覆蓋，刀口皮膚消毒即可。腹腔鏡監(jiān)控移植利用腹腔鏡和配套的器械在不對受體進(jìn)行常規(guī)手術(shù)的情況下將胚胎移植到子宮角，適用于羊、豬等動物。以羊?yàn)槔f明操作方法。在乳房前6cm處的中線兩側(cè)各2cm處分別做兩個(gè)小切口，插入腹腔鏡頭和固定鉗。在腹腔鏡監(jiān)視下，進(jìn)行黃體數(shù)和質(zhì)量評價(jià)，用固定鉗固定宮管結(jié)合部。再從乳房前6cm處的中線上插入一套長7cm、內(nèi)徑7mm的套管針，伸入18號長針刺入子宮角。推動注射器，注入胚胎。每次移植僅需5?8min,比常規(guī)手術(shù)移植快1倍，受胎率40.1%?86%。非手術(shù)法用易胚器械通過子宮頸將胚胎移植于子宮角，本法常用于牛、馬等大動物，豬、羊也有類似方法，但不常用。移植器械：目前多采用專用不銹鋼活塑套移植器，一般由外套、移植管及內(nèi)芯組成，用前消毒。也可用凱蘇輸精槍。移植操作：似牛的人工受精。用直腸把握法將移胚器通過子宮頸，送至黃體側(cè)子宮角前1/3處（大彎或大彎深處）推入胚胎，緩慢抽回移胚器。操作過程應(yīng)輕巧，不可損傷生殖道。如果操作過程中生殖道出血，將會降低受胎率。移植后，要對具體移植情況進(jìn)行記錄。2.7供、受體的術(shù)后管理對術(shù)后的供、受體要注意護(hù)理和飼養(yǎng)管理，保證其健康。同時(shí)要注意觀察，確定其狀態(tài)，并做好記錄。對于供體，要觀察其健康狀況，再預(yù)定時(shí)間是否發(fā)情，如果正常發(fā)情，可以配種。對于受體，要觀察其健康狀況，是否返情，并在一定時(shí)間后要進(jìn)行妊娠診斷，便于妊娠受體加強(qiáng)飼料管理。診斷方法有直腸檢查法和B超診斷法等。胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用胚胎的國際交流以胚胎代替活體動物進(jìn)行種質(zhì)資源交流，不僅可大大降低運(yùn)輸成本，而且可減少疾病的傳播。實(shí)驗(yàn)證明，牛胚胎只要保持透明帶完好，移植前在做適當(dāng)清洗，其傳播疾病的可能性比精液或動物活體都小的多(Sreenan1989),而且，在國內(nèi)外已進(jìn)行的數(shù)以萬計(jì)的胚胎移植，均未爆發(fā)傳染病。優(yōu)良種畜的擴(kuò)群通過胚胎移植技術(shù)使優(yōu)良母畜能較早地獲得較多地后代，擴(kuò)大其在群體遺傳改良中的作用，這對于低繁殖力地畜種和一些本身遺傳素質(zhì)十分優(yōu)秀，卻因某些繁殖障礙而不能妊娠地母畜具有重要意義。建立胚胎庫，保護(hù)動物種質(zhì)資源將胚