【高中生物】基因工程的基本操作程序第2課時課件 2022-2023學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)基因工程的基本操作程序(第二課時)第三章

基因工程復(fù)習(xí)——培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的基本步驟普通棉花（無抗蟲特征）蘇云金芽孢桿菌（有抗蟲特征）提取抗蟲基因棉花細(xì)胞與載體DNA拼接，導(dǎo)入（含抗蟲基因）植物組織培養(yǎng)技術(shù)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定復(fù)習(xí)——目的基因的篩選與獲?。?）人工合成不需要模板①DNA合成儀②反轉(zhuǎn)錄法需要模板（2）從基因文庫中獲取基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）不需要模板（3）利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因需要模板復(fù)習(xí)——PCR技術(shù)變性復(fù)性延伸溫度：90℃以上溫度：50℃左右過程：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與

兩條單鏈DNA結(jié)合溫度：72℃左右過程：4種脫氧核苷酸在耐高溫DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，添加在引物的_____端，合成新的DNA鏈。（引物結(jié)合在模板鏈的______端）反復(fù)循環(huán)過程：目的基因DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃院蠼饩蹫閱捂?’3’基因表達(dá)載體的構(gòu)建(基因工程的核心)構(gòu)建目的：①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?！盎虮磉_(dá)載體”是載體的一種目的基因標(biāo)記基因啟動子終止子復(fù)制原點(diǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)（1）啟動子本質(zhì)：一段有特殊序列的

DNA

片段位置：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)功能：是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA特殊類型：誘導(dǎo)型啟動子特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)（2）終止子本質(zhì)：一段有特殊序列的

DNA

片段位置：位于基因的下游功能：使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停下來啟動子vs起始密碼子終止子vs終止密碼子啟動子vs起始密碼子終止子vs終止密碼子項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)（3）標(biāo)記基因作用：類型：便于重組DNA分子的篩選抗生素抗性基因、熒光蛋白基因（4）復(fù)制原點(diǎn)作用：使基因表達(dá)載體能完成自主復(fù)制基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)構(gòu)建過程：目的基因限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因啟動子限制酶切割位點(diǎn)終止子復(fù)制原點(diǎn)限制酶限制酶DNA連接酶切割目的基因的限制酶和切割基因表達(dá)載體的限制酶一定是同種限制酶嗎？？同種限制酶或能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)構(gòu)建過程：目的基因限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因啟動子限制酶切割位點(diǎn)終止子復(fù)制原點(diǎn)限制酶限制酶DNA連接酶使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？？同種限制酶或能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心)載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1為保證目的基因定向連接，往往選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和質(zhì)粒切割圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因(一般不全破壞)、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建(核心)1、下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯誤的是（）A.啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B.基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動子、終止密碼子、標(biāo)記基因等組件C.人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可激活或抑制目的基因的表達(dá)D.由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別√練習(xí)練習(xí)2.圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述不正確的是()A.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，可用PstⅠ和HindⅢ

切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質(zhì)粒中全部的標(biāo)記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環(huán)化和反向連接D.導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長√將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——Ca2+處理法——顯微注射法方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞重組質(zhì)粒將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——花粉管通道法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——花粉管通道法方法2：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中方法1：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。操作方式花粉外源DNA花粉管子房胚珠將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——花粉管通道法操作方式Ⅱ在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。Ⅰ用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中受體細(xì)胞受精卵地位我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的方法花粉外源DNA花粉管子房胚珠①農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時，Ti質(zhì)粒的_______可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的

。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。實(shí)質(zhì)是基因重組。農(nóng)桿菌特點(diǎn)：②能在自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多單子葉植物沒有侵染能力。T-DNA染色體DNA上Ti質(zhì)粒原核生物T-DNATi質(zhì)粒大型環(huán)狀DNA農(nóng)桿菌將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）實(shí)驗(yàn)思路“兩次拼接”“兩次導(dǎo)入”第一次拼接第二次拼接(非人工操作)第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入(非人工操作)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）實(shí)驗(yàn)具體操作①可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片（即外植體），與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生植株。受體細(xì)胞：體細(xì)胞②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最常用）實(shí)驗(yàn)具體操作①可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片（即外植體），與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生植株。受體細(xì)胞：體細(xì)胞②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等受體細(xì)胞：受精卵將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞——顯微注射法受體細(xì)胞：受精卵②體積大，易操作①受精卵易表現(xiàn)出全能性，能培養(yǎng)成完整個體原因：基因表達(dá)載體提純受精卵胚胎雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)顯微注射新性狀的動物早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植發(fā)育將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法常用方法：受體細(xì)胞：可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)——感受態(tài)原核生物（常選擇大腸桿菌）Ca2+處理目的優(yōu)點(diǎn)遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)，繁殖快。將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca2+處理法常用方法：受體細(xì)胞：可使細(xì)胞處于感受態(tài)原核生物（常選擇大腸桿菌）Ca2+處理目的優(yōu)點(diǎn)遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)，繁殖快。Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.一般不能用真核生物“完整的基因”構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入到原核生物中，原因可能是什么?真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，因此無法表達(dá)出該蛋白。載體真核生物的基因載體導(dǎo)入原核生物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.一般不能用真核生物“完整的基因”構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入到原核生物中，原因可能是什么?真核生物的基因有內(nèi)含子，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機(jī)制，因此無法表達(dá)出該蛋白。以上情況如何解決？使用cDNA作為目的基因或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.若將cDNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，基因表達(dá)出了相關(guān)蛋白，但該蛋白質(zhì)無活性，原因可能是？原核生物缺少高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無法對真核生物的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工以上情況如何解決？人工體外再加工或使用酵母菌等真核生物作為受體細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——Ca2+處理法——顯微注射法方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞受精卵受精卵受精卵or體細(xì)胞原核生物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞練習(xí)（2022·河北石家莊高二期中）我國科學(xué)家將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)肽持参?，富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因編碼區(qū)共含678個堿基對，科學(xué)家利用了XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因?qū)胫参锶~片細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴氨酸的含量比對照組明顯提高。如圖所示是相關(guān)培育過程，下列說法正確的是A.重組質(zhì)粒利用SacⅠ和HindⅢ

切割后能得到1500bp片段，

則表明目的基因正確插入質(zhì)粒B.圖中①過程采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，是因?yàn)檗r(nóng)桿菌易侵染雙子葉植物和裸子植物C.植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加卡那霉素或新霉素都可以用于篩選轉(zhuǎn)基因植株D.①過程前獲得的重組質(zhì)粒只需要兩種工具，即限制酶和DNA連接酶√解析根據(jù)所用限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)可知，由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而插入了目的基因的678個堿基對，加上未移除的