第五章基因工程育種微生物遺傳育種(與“基因”有關的文檔共65張)

第五章基因工程育種微生物遺傳育種第一頁，共65頁。2奠定基因工程的三項關鍵技術DNA的特異切割

Smith和Nathans獲1978年諾貝爾醫(yī)學獎DNA的分子克隆

Berg（1972）將猴病毒SV40DNA與λ噬菌體基因融合，成功構建重組DNA；

Cohen和Boyer（1973）將質粒pSC101與R的tetrkmr基因融合，并將重組DNA轉化E.coli，首次實現(xiàn)了DNA的分子克隆。DNA的快速測序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化學法DNA快速測序技術

1980年諾貝爾化學獎：Berg,Gilbert,Sanger第二頁，共65頁。3分離或合成基因；通過體外重組將基因插入載體；將重組DNA導入細胞；擴增克隆的基因；篩選重組體克??；對克隆的基因進行鑒定或測序；控制外源基因的表達；得到基因產物或轉基因動物、轉基因植物基因工程操作的主要步驟第三頁，共65頁。4第一節(jié)基因克隆的酶學基礎一、限制性核酸內切酶restrictiveendonuclease核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的酶。核糖核酸酶(RNase)與脫氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：exonuclease核酸內切酶：endonuclease第四頁，共65頁。51、寄主控制的限制與修飾作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破壞外源DNA，使之迅速降解機制：限制性核酸內切酶，識別特定的堿基序列并進行切割（2）寄主控制的修飾作用(Modification)作用：保護自身的DNA，使之不受限制機制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。第五頁，共65頁。62、限制性核酸內切酶的類型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修飾限制限制、修飾蛋白質結構3種不同亞基單一成分2種不同亞基所需輔助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM識別序列EcoB:TGA(N)8TGCT4~8bp,旋轉對稱EcoPI:AGACC切割位點距識別位點至少1000kb處隨機切割在識別序列內（或附近）距識別位點3’-端24~26bp處第六頁，共65頁。73、限制性核酸內切酶的命名用產生菌的屬名一個字母(大寫，斜體)＋種名兩個字母(小寫，斜體)[＋菌株名一個字母]＋編號（羅馬數(shù)字）[例]EcoRI,EcoRII：從E.coli

Rye13菌株中獲得HindI，HindII，HindIII：從Haemophilusinfluenzae

d菌株獲得第七頁，共65頁。84、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特征（1）識別序列：一般4~8bp，具有二重旋轉對稱軸，序列呈回文結構(palindromicstructure)例：AluI：5’-AGCT-3’

AsuI：5’-GGNCC-3’

PstI：5’-CTGCAG-3’第八頁，共65頁。9（2）切割：產生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’產生3’-OH單鏈粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’產生5’-P單鏈粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’第九頁，共65頁。10第十頁，共65頁。11酶剪切條件需要鎂離子的存在，特定的酸堿度和離子強度。輔助條件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：雜蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高鹽濃度。其它：甘油濃度等可以改變對序列的識別。第十一頁，共65頁。12狹義：來源不同但識別和切割相同序列的酶。

HpaⅡ與MspI:CCGG廣義：來源于不同物種但能識別相同DNA序列的限制性內切酶，切割位點可以相同也可以不同異功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它們均識別CCCGGG，但前者切后產生鈍末端，后者切后產生粘性末端。（3）同裂酶(isoschizomers)第十二頁，共65頁。13

兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶

BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)第十三頁，共65頁。14二、DNA連接酶（DNAligase）

催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5’-P與3’-OH之間形成磷酸二酯鍵。1、體外DNA連接連接具有互補粘性末端的DNA片段連接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，再行連接第十四頁，共65頁。152、連接用酶（1）T4DNA連接酶：催化反應需要Mg+2,ATP催化粘性末端連接，效率較高催化平末端連接（2）大腸桿菌連接酶催化反應需要NAD+只能催化粘性末端的連接第十五頁，共65頁。16減少載體自身連接的方法：脫磷酸；雙酶切第十六頁，共65頁。17三、反轉錄酶(reversetranscriptase)催化以mRNA為模板的cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：互補于mRNA的DNA片段內含子外顯子

DNA↓轉錄前體mRNA↓修飾成熟mRNA第十七頁，共65頁。18Reversetranscription第十八頁，共65頁。19四、末端轉移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)催化將脫氧核苷酸連接至DNA分子末端的3’-OH上向3’-單鏈末端上連接：Mg+2向平末端上連接：Co+2五、TaqDNA聚合酶來源：棲熱水生菌Thermusaquaticus第十九頁，共65頁。20第二節(jié)基因的克隆載體(cloningvector)克隆載體：以繁殖DNA片段為目的的載體克隆載體的基本要求在細胞中能進行自主復制，為松弛型;具有多種限制酶的單一切割位點，便于外源DNA的插入，并且插入后不影響載體的復制;容易進入宿主細胞，進入效率越高越好，并且容易從宿主細胞中分離純化出來，以便于重組操作;具有可供選擇的遺傳標記第二十頁，共65頁。21一、質粒載體1、質粒的一般生物學特性

(1)環(huán)狀雙鏈質粒DNA的構型共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA):兩條鏈均保持完整的環(huán)狀構型，通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構型開環(huán)DNA(ocDNA)：一條鏈保持完整的環(huán)狀結構，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口，即OC構型線形DNA(lDNA)：質粒DNA經(jīng)過適當?shù)南拗菩院怂醿惹忻傅那懈詈?，發(fā)生雙鏈斷裂，稱L構型第二十一頁，共65頁。22第二十二頁，共65頁。23(2)表型效應性別：F，SCP1抗生素類物質合成：SCP1，Col抗藥性：R分解性質粒：CAM(樟腦)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隱蔽性質粒(crypticplasmid)：2m第二十三頁，共65頁。24(3)質粒的分類分子量：大型質粒：MW>40×106d

小型質粒：MW<10×106d復制類型嚴緊型質粒(stringent)：1~3copies/cell

松弛型質粒(relaxed)：10~60,ormore第二十四頁，共65頁。25接合類型接合型質粒(conjugative)

非接合型質粒(nonconjugative)質粒的不親和性(incompatibility)

在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。同一不親和群：不能共存于同一細胞中不同的不親和群：能共存于同一細胞中第二十五頁，共65頁。26(4)質粒的命名①質粒名以三個英文字母加阿拉伯數(shù)字表示

pUC19plasmid發(fā)現(xiàn)者或實驗室名編號(小寫）（大寫）第二十六頁，共65頁。27②為了說明質粒的來源、性狀，有時需要標出缺失、插入等pXY9109：FDtraA3(63.1-64.0kb)pXY2101：pXY101W4[0kb:k12hisA:1.5kb](5)與質粒有關的菌株的命名E.colik12:E.coliC600：k12(F-)(l-)thrleutonAlacYthiE.coliXY100：C600(F’155)(pXY1234)第二十七頁，共65頁。282、質粒克隆載體（1）特性具有獨立復制起點;具有較小的相對分子量（1~200kb）,克隆外源DNA片段一般不超過15kb；具有較高的拷貝數(shù)（10~200）；具有便于選擇的標記；易于導入細胞；具有安全性第二十八頁，共65頁。29（2）克隆質粒載體第二十九頁，共65頁。30第三十頁，共65頁。31質粒分離的步驟：粗提精提第三十一頁，共65頁。32氯化銫梯度離心法：有效地去除蛋白質、RNA、染色體DNA、受損質粒。第三十二頁，共65頁。33二、l噬菌體克隆載體1、優(yōu)點遺傳學背景十分清楚載體容量大，~23kb具有較高的感染效率2、類型插入型載體:較小片段DNA的插入（10kb以內）；取代型載體：較大片段DNA的插入；重組DNA分子大小為l噬菌體DNA的75～105％；野生型λDNA為48kb，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應是23kb。第三十三頁，共65頁。34插入型載體第三十四頁，共65頁。35取代型載體第三十五頁，共65頁。363、l噬菌體克隆載體的導入轉染：用λ重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細胞內。效率低：未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的λDNA，其典型的轉染效率也僅為105～106噬菌斑/微克λDNA，體外連接的結果，轉染效率便下降到了104～103左右。λDNA的體外包裝：在離體條件下，將重組體DNA包入噬菌體等病毒顆粒，形成有感染功能的病毒載體。第三十六頁，共65頁。37三、柯斯質粒載體(cosmidvector)

由l噬菌體的粘性末端和質粒構建而成。含有來自質粒的一個復制起點、抗藥性標記、一個或多個限制酶單一位點，來自l噬菌體粘性末端的DNA片段（cos位點）。第三十七頁，共65頁。38優(yōu)點具有l(wèi)噬菌體的特性，在體外包裝后具有噬菌體的高效感染力；具有質粒DNA的復制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有與同源序列的質粒進行重組的能力第三十八頁，共65頁。39柯斯克?。╟osmidcloning）應用柯斯質粒載體，在大腸桿菌細胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術第三十九頁，共65頁。40第三節(jié)基因工程的基本操作一、目的基因的獲得1、從供體細胞的DNA中分離

（基因文庫的構建）基因文庫：某生物染色體基因組各DNA片段的克隆總體。如“鳥槍法”(ShotgunMethod)第四十頁，共65頁。41步驟提取染色體DNA限制酶解電泳分離與載體連接導入宿主篩選陽性克隆第四十一頁，共65頁。422、從mRNA合成cDNA(cDNA文庫構建）所謂cDNA文庫是指某生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。第四十二頁，共65頁。43步驟提取mRNA反轉錄合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈與載體連接導入宿主細胞篩選陽性克隆第四十三頁，共65頁。443、PCR體外擴增目的基因PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶鏈式反應：利用特殊的DNA聚合酶，在體外擴增位于兩段已知序列之間的特定DNA區(qū)段的方法。(1)PCR組成：含目標DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq或PfudNTPs緩沖體系和金屬離子第四十四頁，共65頁。45(2)PCR過程變性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：40~60℃延伸(extension)：72℃

如此進行20~40個循環(huán)，DNA量擴增106~107倍。第四十五頁，共65頁。46第四十六頁，共65頁。47第四十七頁，共65頁。484、基因的化學合成主要應用于已知核苷酸序列的、分子量較小的基因的制備。通常先合成一定長度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再組裝成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法和自動化法等。第四十八頁，共65頁。49二、目的DNA與載體的連接1、粘性末端連接2、平齊末端連接3、同聚末端連接4、人工接頭連接第四十九頁，共65頁。50三、重組DNA導入宿主細胞1、轉化或轉染2、體外包裝與感染3、電穿孔法electroporation常用宿主系統(tǒng)第五十頁，共65頁。51過程：連接反應的混合液+感受態(tài)細胞;

冰浴10至30分鐘;

熱休克0.5至2分鐘;

加入培養(yǎng)基37C振蕩培養(yǎng)1小時;

涂布平板，培養(yǎng)。第五十一頁，共65頁。52四、重組體的篩選與鑒定1、遺傳學方法：檢測選擇性標記2、核酸雜交方法：檢測目的基因3、免疫化學方法：檢測目的基因產物4、直接檢出法：檢測目的基因產物第五十二頁，共65頁。53五、DNA序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法1、試劑引物模板：待測序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP第五十三頁，共65頁。542、測序反應3、制備聚丙烯酰胺凝膠3、凝膠加樣4、電泳5、結果記錄與分析第五十四頁，共65頁。55第五十五頁，共65頁。56第五十六頁，共65頁。57六、外源基因的表達影響表達的因素細胞中基因拷貝數(shù)：拷貝數(shù)多，產物多轉錄水平：啟動子與RNA多聚酶的統(tǒng)一翻譯水平：mRNA的核糖體結合部位與宿主核糖體的統(tǒng)一；密碼子與tRNA的統(tǒng)一；mRNA的穩(wěn)定性外源基因的插入方向轉錄后的修飾及翻譯后的修飾第五十七頁，共65頁。58第四節(jié)基因工程的實際應用微生物發(fā)酵病毒疫苗哺乳動物蛋白（人源蛋白藥物）轉基因動植物環(huán)境生物技術基因診斷與基因治療蛋白質工程（定點突變、定向進化）代謝工程第五十八頁，共65頁。59復習題1、何謂基因工程？基因工程操作主要步驟。2、何謂限制性核酸內切酶？Ⅱ型限制性核酸內切酶有何特點？3、克隆載體的基本要求。4、質粒的表型效應、分類、命名。5、目的基因的獲得途徑6、名詞：基因文庫、cDNA文庫、PCR、質粒不親和性第五十九頁，共65頁。60插入鈍化/失活（insertionalinactivation)由于外源