病原性球菌及檢驗

病原性球菌及檢驗球菌種類許多，依據革蘭氏染色的不同，分為G，G'兩類球菌。不有:葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌和微球菌。G有：腦膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、卡他布蘭漢氏菌等。對人體致病的球菌稱病原性球菌，因能引起機體化膿性炎癥，故又稱為化膿性球菌。常見的有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌。一、葡萄球菌屬（一）形態(tài)與染色葡萄球菌呈不規(guī)章堆集排列，形似葡萄串狀，也可見單個、成對或短鏈排列。為甲性球菌，直徑0.5-1.5um,（致病性葡萄球菌菌體較非致病性葡萄球菌菌體?。o芽胞，無鞭毛、無莢膜；無動力。（二）分類1965年按血漿凝固酶分為：血漿凝固酶陰性葡萄球菌，血漿凝固酶陽性葡萄球菌。.血漿凝固酶陰性葡萄球菌包括：表皮、腐生葡萄球菌。.血漿凝固酶陽性葡萄球菌包括：金黃色、中間型、家畜葡萄球菌。（三）抗原本菌水解后，用沉淀法可獲兩種抗原即蛋白抗原和多糖抗原。.蛋白抗原：是一種表面抗原，為完全抗原；有種特異性，無型特異性。存在葡萄球菌細胞壁的表面，結合在細胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，稱葡萄球菌A蛋白。.多糖抗原：是半抗原，存在于細胞壁上，是金黃色葡萄球菌的重要抗原。有型特異性，分A、B、C三型。（四）標本接種.膿汁、尿道分泌物、腦脊液沉淀物，通常直接接種在血瓊脂上，經37°C24-48h培育，可見直徑2-3mm,產生不同色素的菌落。.糞便、嘔吐物應接種卵黃高鹽、高鹽甘露醇瓊脂平板上，經37℃24-48h培育可形成細小菌落，48h后形成典型菌落。.疑為敗血癥者，抽取靜脈血5ml,注入50ml葡萄糖肉湯培育基中。（五）培育特性需氧或兼性厭氧，對養(yǎng)分要求不高。在20%C（）2環(huán)境中，有利于毒力產生。最適溫度37℃,最適PH7.4。DNA中G+C含量：30-39%o.在一般瓊脂平板上，經37℃、24-48h培育，可形成圓形，凸起、邊緣整齊、表面光滑、潮濕、有光澤、不透亮 、脂溶性色素的菌落，直徑一般為但大者也有4-5mm的菌落。.在高鹽甘露醇血平板上，致病性的的葡萄球菌能分解甘露醇，其菌落呈淡橙黃色。.在卵黃高鹽瓊脂平板上，由于致病性的的葡萄球菌能產生卵磷脂酶，因此在培育基其菌落四周形成白色沉淀圈。.在血平板上，幾乎全部的葡萄球菌可產生a、§、丫和6溶血素。.在肉湯（液體）培育基中，其生長快速呈勻稱混濁狀，并有部分細菌沉淀于管底，搖動易消散。（六）生化反應.葡萄球菌觸酶（3%H202）試驗陽性（+）操作方法：挑取培育基上的菌落，置于干凈的玻片上，然后滴加3%比。2溶液1-2滴，靜置之。觀看結果：1min內產生大量氣泡為陽性，反之不產生氣泡為陰性。.葡萄球菌氧化酶試驗陰性（-）.多數葡萄球能分解葡萄糖、麥芽糖及庶糖，產酸不產氣。.多數致病性葡萄球菌能分解甘露醇、液化明膠和產生血漿凝固酶。但并不以次作為有無致病性的依據。.葡萄球菌凝固酶試驗操作方法：取生理鹽水4倍稀釋的血漿0.5ml,然后挑取3-5個菌落于稀釋血漿中作成菌懸液，置37℃水浴。觀看結果：3-4h后消失凝固者為陽性。應見到明顯的纖維蛋白塊，消失羊毛狀或纖維狀沉淀狀物并非真正凝固，應判為陰性。.葡萄球0F試驗 此試臉應使用葡萄球菌專用0F管，不行與非發(fā)酵菌用的0F管混用。操作方法：挑取被檢菌落，接種于2支0-F管中，發(fā)酵管加滅菌液體石蠟約1cm深，氧化管不加石蠟。觀看結果：35℃孵育24h后觀看，產酸即變黃色。結果判定：見表17。表1T0F試驗鑒定表代謝型加 石 蠟不加 石蠟發(fā)酵型產酸變黃色產酸變黃色氧化型不變色產酸變黃色（七）致病性葡萄球菌鑒定依據.涂片鏡檢為G.性葡萄狀排列的球菌2,產生脂溶性金黃色色素.平板上菌落有透亮 溶血環(huán).血漿凝固酶試驗陽性（+）.發(fā)酵甘露醇（+）（八）鑒別診斷.葡萄球菌屬的鑒別（1）葡萄球菌屬內27個種的鑒別，祥見（其次版）§476-477頁。其中27個種的診斷性藥物鑒別：見表1-2。表1-2葡萄球菌屬27中細菌藥物敏感性鑒別自制診斷藥物標準敏感性葡萄球菌屬細菌名稱新/S多/S人、頭、耳、表皮、肌肉、溶血、中間、解、仿照、華納、施萊福新生霉素50ug/片R<16mm新/S多/R金黃色、產色、豬葡萄球菌新/S多/ND金厭氧亞種、頭解腺亞種、解糖、海豚、里昂葡萄球菌多粘菌素BR<10mm新/R多/S腐生、孔氏、孔氏麻亞種、木糖、柯氏、松鼠、緩慢、雞葡萄球菌300ug/片新/R多/ND馬葡萄球菌、阿來特葡萄球菌（2）葡萄球菌屬內的三個種的鑒別：見表1-3。表1-3葡萄球菌三個種的鑒別金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶甘露醇發(fā)酵A蛋白新生霉素+ - -+ -+ - -S S R(3)有臨床意義的8種常見葡萄球菌關鍵性鑒定：祥見§478頁。.微球菌科內的鑒別(1)葡萄球菌與微球菌鑒別：見表1-4。微球菌屬球形、四聯狀RW9S(10-25mm)表1-4微球菌屬球形、四聯狀RW9S(10-25mm)葡萄球菌屬球形、葡萄狀TOC\o"1-5"\h\z發(fā)酵葡萄糖產酸 +溶葡萄球菌素(200ug/ml)敏感 +甘油-紅霉素(0.4ug/ml)培育基產酸 +。夫喃喳酮 dooug/片) S>15mm桿菌肽 (0.04U/片) RW9mm(2)葡萄球菌與其它G,球菌的鑒別：祥見§475頁。.葡萄球菌與鏈球菌球菌的鑒別(1)形態(tài)(2)觸酶試驗，鏈球菌陰性。(九)致病性葡萄球菌的致病力的強弱與其產生的毒素和酶有關。.溶血毒素可分為a、3、丫、6、￡五種，對人類有致病作用的主要是a溶血毒素。a溶血毒素為蛋白質，對白細胞、血小板幾多種組織細胞有毒性作用，能使局部小血管收縮，導致局部缺血壞死。p溶血毒素有稱“冷熱溶血素”。丫、6溶血素對人和動物紅細胞均能溶血。.腸毒素腸毒素是一種可溶性蛋白質，重要作用于腸壁，并通過傳入神經到達嘔吐中樞而引起嘔吐。金黃色葡萄球菌的某些溶血菌株產生的一種引起急性胃腸炎的腸毒素，此種菌株可污染食物，入食后可引起中毒。葡萄球菌腸毒素分為A、B、G、C2、C3、D、E、F等8個血清型。除F型與中毒性休克綜合征有關外，均能引起食物中毒，以A、D型多見。.血漿凝固酶血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產生的一種與其致病性有關的侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白原在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細胞的吞噬。大多數致病性葡萄球菌能產生此酶，因此血漿凝固酶是鑒定葡萄球菌有無致病性的重要指標，但有些血漿凝固酶試臉陰性的菌株也可致病。.還有殺白細胞素、.剝脫性毒素、.中毒性休克綜合征毒素等。（十）所致疾病本菌感染部位的特點是組織化膿、壞死和膿腫的形成。.金黃色葡萄球菌是引起感染最常見的葡萄球菌。.表皮葡萄球菌是存在皮膚的正常棲居菌，該菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，是導致血培育污染的的常見細菌之一。.腐生葡萄球菌是導致尿路感染的常見病原菌之一。（十一）反抗力耐熱、耐干燥、耐高鹽，是反抗力最強的無芽胞的細菌。濕度80℃30-60分鐘才能被殺死；在含1075%Nacl培育基中依能生長。對萬古霉素、替考拉寧、大蒜素、吠喃喳酮較敏感；對青霉素G耐藥的菌株據統計1946年僅占14%,1966年已高達97%。（十二）藥敏須知紙片法檢測甲氧西林對葡萄球菌敏感性是用1ug/片的苯喳西林紙片檢測的，由于常消失假陽性現象，因此，2004年美國臨床試驗室標準化委員會（NCCLS）建議：.用30ug/片的頭抱西丁代替苯喳西林檢測mecA介導的葡萄球菌耐藥。結果應報苯喳西林耐藥，而不是頭抱西丁耐藥。.頭抱西丁抑菌環(huán)直徑推斷標準：（1）金黃色葡萄球菌，R^19mm;S^20mmo（2）凝固酶陰性的葡萄球菌，RW24mm;S225mm。.報■告：.葡萄球菌屬藥敏紙片選擇A、苯喳西林\青霉素）B、萬古霉素、復方新諾明、克林霉素、（紅霉素:阿齊霉素一克拉霉素b）、Linezolid。C、慶大霉素、氯霉素\四環(huán)素C、利福平"、奎奴普汀/達福普汀I、（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、加替沙星）。二、鏈球菌屬.形態(tài)與染色鏈球菌呈圓形或橢圓形，直徑0.5-2.0um,成對或長短不一的鏈狀排列。為C性球菌，無芽胞、鞭毛、動力；多數菌株在含有血清肉湯的培育基中培育2~4h易見有莢膜，以后又漸漸消逝。.分類鏈球菌分類方法許多，常用的有以下兩種：(1)依據鏈球菌在血平板上溶血狀況分成三大類。1>甲型⑸溶血性鏈球菌：通稱甲型鏈球菌或草綠色鏈球菌，菌落呈灰色針尖狀，在菌落四周有寬廣2mm的草綠色溶血環(huán)(a-型溶血)。2>乙型⑹溶血性鏈球菌：通稱溶血性鏈球菌，菌落較小、灰白色、在四周有寬2~4mm的透亮 溶血環(huán)(§-型溶血)。3>丙型(丫)鏈球菌：通稱不溶血性鏈球菌，呈灰白色小菌落，在菌落四周無溶血環(huán)。(2)依據鏈球菌細胞壁(C抗原)抗原構造分類.抗原 鏈球菌含有多種抗原且構造簡單，如乙型溶血性鏈球菌菌體抗原可分為三種：(1)群特異性抗原簡稱C抗原，常用Lancefield血清分解法，將乙型溶血性鏈球菌分為A、B、C、D……T等18個群(其中缺I、J),近年來又增加了U、V群，目前已進展到20個群。(2)型特異性抗原簡稱表面抗原，是鏈球菌細胞壁的蛋白質抗原，位于C抗原的外層，其又分為M、T、R、S四種抗原。M抗原與鏈球菌致病性有關。依據M抗原的不同，可將A群鏈球菌分成80個型。(3)非特異性抗原簡稱P抗原，無特異性，不能用作分類。.標本接種(1)血液標本，以無菌操作取兩份血液各2~3ml,分別置需氧和厭氧環(huán)境中增菌，然后分別接種于兩個血平板，置需氧和厭氧環(huán)境中培育。(2)膿汁和咽拭標本接可直接種血平板。.培育特性本菌大多數為需氧或兼性厭氧，少數為專性厭氧。對養(yǎng)分要求較高，在含有葡萄糖、血清、血液、腹水的培育基中生長良好。生長溫度范圍為25?45℃,最適溫度為37℃,最適PH7.4-7.6,在5%CO2環(huán)境下生長更好。DNA中G+C含量：34-46%o(1)在液體培育基如血清肉湯中，溶血性菌株在管底呈絮狀或顆粒狀沉淀生長，且鏈較長；不溶血的菌株則呈勻稱生長。(2)在血瓊脂平板上，經37°C,18-24h培育，可形成灰白色、圓形、凸起、直徑為0.1-0.75um的細小菌落。在菌落的四周由于鏈球菌種類的不同可見不同類型的溶血環(huán)。如草綠色、透亮 或無溶血環(huán)。.生化反應(1)鏈球菌觸酶試驗陰性(-)(2)鏈球菌能分解葡萄糖產酸(乳酸)不產氣(3)桿菌肽敏感試驗A群鏈球菌，此試驗敏感(S)o操作方法：挑取大量被檢菌落，密涂于血平板上，以免消失假陽性。貼上含0.04U/片的桿菌肽紙片，35℃孵育過夜。觀看結果：形成抑菌環(huán)為敏感。A群鏈球菌的敏感率約占97%。CAMP試驗B群鏈球菌，此試驗陽性(+)。操作方法：在血平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一條直線，再將被檢菌距金黃色葡萄球菌3mm處垂直種一條短線。同樣方法接種陰陽性對比菌。35℃孵育過夜。觀看結果：陽性(+),在被檢菌接種線與金黃色葡萄菌接種線之間有一個失形(半月形、箭頭狀)的加強溶血區(qū)。即CAMP試驗陽性。SXT敏感試驗 A、B群鏈球菌耐藥(R),其他群敏感(S)o(6)七葉昔試驗G群鏈球菌此試驗陽性(+)操作方法：接種生化管，35℃孵育18-24h。觀看結果：陽性(+),棕黑色；陰性(-),不變色。(7)膽汁七葉昔試驗D群鏈球菌(非D群陽球菌)此試驗陽性(+)因能在40%膽汁中生長，所以此試驗陽性。方法，結果同七葉苔試臉。(8)Optocian敏感試驗操作方法：挑取被檢菌落，密涂于平板上，貼Optocian紙片于接種處，35℃燭缸孵育18ho觀看結果：抑菌環(huán)直徑214mm為敏感，推斷為肺炎鏈球菌。7.鑒定依據 首先確認鏈球菌后，再作屬內鑒定。為了鑒定便利，依據溶血性急膽汁七葉苔試驗將鏈球菌初步分群。(1)乙型溶血性鏈球菌群鑒定本群與臨床有關的是A、B、C、D、F、G血清群，其中F、C群主要依據抗血清鑒定。鑒定如下，祥見(其次版)§481頁表5-3-5。1>血平板上呈P（透亮 ）型溶血2>A群，桿菌肽試驗（S）,SXT試驗（R）o3>B群，CAMP試驗（+）,SXT試驗（R）,馬尿酸鈉水解（+）。〈4〉G群，七葉苔試驗（+）,可與B群相鑒別。（2）甲型鏈球菌群鑒定 鑒定如下，祥見課本§77頁表8-61>血平板上呈口（草綠色）型溶血2>膽汁七葉甘試驗陰性（-）3>庶糖陽性（+）4>萬古霉素敏感（S）8,鑒別診斷屬間鑒別，關鍵是在形態(tài)、染色和觸酶試驗的區(qū)分。在臨床標本檢查的G二觸酶陰性的球菌，除鏈球菌屬外，尚有6個菌屬。與鏈球菌相鑒別祥見祥（其次版）§480-483頁，表5-3-4,8、9、10。9.致病物質 致病物質主要有鏈球菌溶血素、致熱外毒素、透亮質酸酶、鏈激酶、鏈道酶及M蛋白等。（1）溶血素 具有溶解紅細胞、破壞白細胞和損壞心肌的作用。包括有0、S、D及胞內溶血素四種，其中主要是0及S兩種。<1>溶血素0（SL0）耐熱，為含-SH基的蛋白質。體內可產生抗鏈球菌