植物病原細菌研究方法

關于植物病原細菌研究方法第1頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月內容提綱：細菌的基本形態(tài)特征常規(guī)細菌生理生化檢測方法細菌種類鑒定方法植物病原細菌檢測和細菌病害診斷方法有益細菌的利用研究第2頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細菌的基本形態(tài)特征

細菌（bacteria）是單細胞原核微生物，個體微小，形態(tài)簡單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細菌分布最廣、數(shù)量最多。第3頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌的形態(tài)和大小細菌的細胞結構細菌的繁殖與群體形態(tài)第4頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）細菌的大小細菌大小的測定：(1)測量：

測微尺(2)長度單位：微米(μm)(3)表示：

球菌：直徑桿菌：

寬×長

螺菌：

寬、長、螺距第5頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

通常球菌直徑：0.2—

1.5

μm，

桿菌:長1—5μm,寬0.5—1μm。例如：大腸桿菌：平均長度：2μm；寬度0.5μm

1500個大腸桿菌頭尾相接等于3mm;109個大腸桿菌重1mg.

由于菌種不同，細菌的大小存在很大的差異；對于同一個菌種，細胞的大小也常隨著菌齡變化。另外，對于同一個菌種染色前后其細胞大小都有所不同。所以，有關細菌大小的記載，常是平均值或代表性數(shù)值。第7頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

菌名

直徑或寬×長

（μm×μm）乳鏈球菌金黃色葡萄球菌大腸桿菌枯草芽孢桿菌霍亂弧菌

0.5~10.8~10.5×(1~3)(0.8~1.2)×(1.2~3)(0.2~0.6)×(1~3)

細菌細胞的大小第8頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、細菌的形態(tài)

不同細菌的形態(tài)可以說是千差萬別，豐富多彩，但就單個有機體而言，其基本形態(tài)可分為球狀、桿狀與螺旋狀三種.

除了球菌、桿菌、蛆旋菌三種基本形態(tài)外，還有許多具其他形態(tài)的細菌。例如柄桿菌細胞上有柄、菌絲、附器等細胞質伸出物，細胞呈桿狀或梭狀，并有特征性的細柄；球衣菌能形成衣峭，桿狀的細胞呈鏈狀排列在衣鞘內而成為絲狀,而支原體由于只有細胞膜，沒有紉胞壁，故細胞柔軟，形態(tài)多變，具有高度多形性。另外，人們還發(fā)現(xiàn)了細胞呈星形和方形的細菌。第9頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

球狀、桿狀和螺旋狀細菌的三種基本形態(tài):

第10頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1.球菌單球菌雙球菌鏈球菌四聯(lián)球菌八疊球菌

葡萄球菌第11頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2.桿菌

桿菌是細菌中種類最多的類型,因菌種不同,菌體細胞的長短、粗細等都有所差異。

桿菌的形態(tài)：短桿狀、長桿狀、棒桿狀、梭狀、梭桿狀、月亮狀、分枝狀、竹節(jié)狀等；按桿菌細胞的排列方式則有鏈狀、柵狀、“八”字狀以及有鞘衣的絲狀等。第12頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2.桿菌短桿菌長桿菌梭狀芽孢桿菌第13頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鏈狀桿菌單桿菌2.桿菌第14頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月桿菌細胞兩端的形態(tài)特征2.桿菌第15頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月3、螺旋菌

螺旋狀的細菌稱為螺旋菌。

根據(jù)其彎曲情況分為：

弧菌：螺旋不滿一圈，菌體呈弧形或逗號形

例：霍亂弧菌、逗號弧菌

螺旋菌：螺旋滿2—6環(huán)，螺旋狀

例：干酪螺菌

螺旋體：旋轉周數(shù)在6環(huán)以上，菌體柔軟。

例：梅毒密螺旋體第16頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月螺旋菌弧菌螺旋體3、螺旋菌第17頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細菌的特殊形態(tài)：

柄細菌、腎形菌、臂微菌、網(wǎng)格硫細菌、貝日阿托氏菌(絲狀)、具有子實體的粘細菌、三角形、方形等特殊形態(tài)的細菌。第18頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細菌的特殊形態(tài)第19頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月二、細菌的細胞結構基本結構包括：

細胞壁、細胞膜、細胞質、核區(qū)、間體、核糖體、氣泡和儲藏物。

特殊結構包括：莢膜、鞭毛、纖毛、芽孢。

第20頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌細胞結構第21頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1.固體斜面培養(yǎng)2.液體培養(yǎng)基

3.半固體培養(yǎng)第22頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細菌概述

絕大多數(shù)為好氣性細菌；生長溫度大多為25-28℃，少數(shù)可以20℃或在35℃中（如青枯菌）生長。植物病原細菌都不產(chǎn)生芽孢，因此對高溫比較敏感，一般在50℃左右的熱水中處理10分鐘即失活，適宜的pH為6-7。第23頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細菌的革蘭氏染色（細菌的革蘭氏染色反應是細菌分類鑒定的一個重要特征）常規(guī)細菌生理生化檢測方法第24頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月細菌細胞壁的結構革蘭氏陽性菌細胞壁：由肽聚糖和磷壁酸組成

磷壁酸：占40%。G+菌所特有,其主鏈由數(shù)十個磷酸甘油或磷酸核糖醇組成,有的還有由D—Ala和還原糖組成的側鏈。

肽聚糖:占30~70%,不同菌種中肽聚糖(肽鏈)組分不同。第25頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏陰性菌細胞壁：分內壁層和外壁層。

內壁層：緊貼胞膜,僅由1—2層肽聚糖分子構成,占細胞壁干重5-10%,無磷壁酸。外壁層：位于肽聚糖層的外部。脂多糖;

脂蛋白、

包括:蛋白質層:基質蛋白、

外壁蛋白;

磷脂.第26頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色的原理第27頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色原理：第一步：結晶紫使菌體著上紫色；第二步：碘和結晶紫形成大分子復合物，分子大，能被細胞壁阻留在細胞內；第三步：酒精脫色，細胞壁成分和構造不同，出現(xiàn)不同的反應；G+菌：細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結晶紫-碘復合物被阻留在細胞內，細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色；Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，沙黃復染后呈紅色。第28頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

革蘭氏染色法是細菌細胞的復合染色法，由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立?；静襟E：

涂片固定——

結晶紫初染1min——

碘液媒染1min——95%乙醇脫色0.5min——

番紅復染min

結果:

革蘭氏陽性菌——紫色；

革蘭氏陰性菌——紅色。①革蘭氏染色法：第29頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗材料待測細菌枯草芽孢桿菌（G+）甘藍黑腐病菌（G-）染液：結晶紫草酸銨染劑、魯戈爾碘液、復染劑（番紅O）用具：移植餌、清潔無脂載玻片第30頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月清潔無脂載玻片陽性對照菌（紫色或藍黑色）待測菌陰性對照菌（紅色）示范圖對照菌呈現(xiàn)正確顏色，實驗才為成功第31頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月涂片干燥固定染色1min水洗、吸干鏡檢簡單染色制備涂片標本→染色第32頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月陽性菌陰性菌①革蘭氏染色法第33頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陰性——大腸桿菌第34頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月革蘭氏染色陽性——枯草芽孢桿菌第35頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

注：

（1）、實驗細菌為活躍生長期的培養(yǎng)物；

（2）、菌液不能太濃，涂片不宜過厚，造成假陽性；

（3）、火焰固定涂片，以載玻片不燙手為宜；

（4）、脫色時間把握好，過長，假陰性；過短，假陽性。第36頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛：某些細菌表面由細胞內生出的細長、波曲、毛發(fā)狀的結構。鞭毛具有運動功能，一般認為鞭毛靠鞭毛絲旋轉而動，它們是細菌的“運動器官”。鞭毛的長度：一般為15—20μm，最長可達70μm。鞭毛的直徑：為0.01—0.02μm.不同細菌的鞭毛數(shù)目和著生位置不同，鞭毛數(shù)目一般一至數(shù)十條。細菌鞭毛染色第37頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的著生方式：周生第38頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的化學組成：

主要由鞭毛蛋白構成，還含有少量的多糖、脂類和核酸等。鞭毛起源于細胞質膜內側的基粒。

細胞質區(qū)內有一個顆粒狀小體，此小體為基粒，鞭毛自基粒長出穿過細胞壁延伸到細胞外部。第39頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

鞭毛的結構：

鞭毛絲鞭毛鞭毛鉤基體第40頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鞭毛的觀察：電鏡特殊鞭毛染色，在光學顯微鏡下觀察半固體穿刺培養(yǎng)從固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)判斷一般情況下：菌落形狀大，薄且不規(guī)則，邊緣極不平整，可能有鞭毛。菌落十分圓滑，邊緣平整且相對較厚，可能沒有鞭毛。第41頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

實驗菌種及藥品

1．菌種：枯草芽孢桿菌

2．染液

染液A：

單寧酸5.0g

氯化鐵（Fecl36H2O）1.5g

福爾馬林（15％）2.0ml（15%福爾馬林：40%甲醛4ml+蒸餾水6ml）

NaOH(1%)1.0ml

蒸餾水100ml

染液B：

硝酸銀2g蒸餾水100ml第42頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月三、染色方法：銀鹽染色法

硝酸銀溶于蒸餾水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸銀溶液中逐滴加濃氫氧化銨，先形成很濃的沉淀，再繼續(xù)滴加濃氫氧化銨至沉淀消失為止。然后慢慢滴入備用的硝酸銀溶液則出現(xiàn)少量霧狀沉淀，但輕輕搖動后，沉淀又消失，再滴入硝酸銀溶液，直到搖動后霧狀沉淀不再消失為止。此液不耐保存，4小時內染色效果最佳。第43頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、鞭毛染色步驟：

（1）將菌株在NA斜面上于30℃恒溫箱中培養(yǎng)17-20小時，取出，沿壁管輕輕加入3-5ml的滅菌水掩蓋斜面菌苔。斜放靜置10分鐘，使細菌自然游出，勿搖動，備用。

（2）用移植環(huán)取菌懸液于無劃痕的無脂玻片上，傾斜玻片，使之成帶狀，將玻片在空氣中自然風干。

（3）滴加染液A于干燥的涂片上，覆蓋涂片，染色10-13分鐘，傾去染液，用蒸餾水充分洗去染液；風干后，再滴加染液B覆蓋涂片染色30秒至1分鐘，立即用蒸餾水沖洗，放于空氣中干燥，在高倍鏡或油鏡下鏡檢。

（4）在金色背景下，細菌鞭毛深褐色到黑色，菌體淺褐色。

第44頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第45頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第46頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌體鞭毛第48頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢概念：某些菌生長到一定階段，細胞內形成一個圓形、橢圓形或卵圓形的內生孢子，是對不良環(huán)境有較強抵抗力的休眠體。

芽孢第49頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月能形成芽孢的細菌種類：

在桿菌中能形成芽孢的種類較多，在球菌和螺旋菌中只有少數(shù)菌種可形成芽孢。產(chǎn)生芽孢的幾個屬：芽孢桿菌屬梭狀芽孢桿菌屬芽孢乳桿菌屬生孢八疊球菌屬（其中的一個種）第50頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的形態(tài)及其在細胞中的位置：

A近中央

B末端

C中央第51頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

細菌芽孢的各種類型第52頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的組成和結構

芽孢有多層結構，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮層和核心.芽孢的結構芽孢的外壁層厚而致密，主要成分為脂蛋白，通透性差,不易著色。核心含有大量的DNA、RNA、蛋白質酶等物質，還含有2,6—吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以DPA—Ca的形式存在。皮層主要含芽孢肽聚糖、DPA—Ca，皮層體積大，比較致密。芽孢平均含水量低,約40%.第53頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢的特性:具有很強的抗熱、抗干燥、抗輻射、抗化學藥物能力。含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易著色。新陳代謝幾乎停止，處于休眠狀態(tài)。一個芽孢萌發(fā)產(chǎn)生一個個體。芽孢的抗熱機制：

目前尚不清楚，但可能與以下因素有關，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比較耐熱。第54頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢染色（孔雀綠藏紅染色）

染劑Ⅰ孔雀綠水溶液5％染劑Ⅱ

藏紅水溶液0.5％或堿性品紅水溶液0.05％染色方法：

1、涂片固定；

2、加染劑Ⅰ在酒精燈火焰上加熱染色1min，勿使染液沸騰和干燥；

3、水洗；

4、染劑Ⅱ染色15s；

5、水洗，風干后鏡檢。菌體染成紅色，芽孢染成綠色。第55頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月芽孢菌體第56頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月常規(guī)鑒定方法全自動微生物鑒定儀--Biolog

植物病原細菌的鑒定方法第57頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌落特征比較

常規(guī)細菌鑒定方法參考：東秀珠等，常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊，科學出版社，2001第58頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第59頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月全自動微生物鑒定儀--Biolog鑒定原理

Biolog公司獨創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對不同碳源代謝率的差異，針對每一類微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類顯色物質（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔為陰性對照），接種菌懸液后培養(yǎng)一定時間，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質發(fā)生反應而導致的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長造成的濁度差異（濁度），與標準菌株數(shù)據(jù)庫進行比對，即可得出最終鑒定結果。

第60頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第61頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月主要特點

·快速讀取結果

鑒定板由讀數(shù)儀自動讀取吸光值，軟件將該吸光值與數(shù)據(jù)庫對比，就可在瞬時給出鑒定結果。試驗結果可由系統(tǒng)進行自動分析、記錄和打印。

·強大的數(shù)據(jù)庫

Biolog微生物鑒定數(shù)據(jù)庫容量是目前世界上最大的，可鑒定包括細菌、酵母和絲狀真菌在內總計1973種微生物，幾乎涵蓋了所有的人類、動物、植物病原菌以及食品和環(huán)境微生物。第62頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG在植物病原菌鑒定方面

可鑒定常見的假單胞菌(Pseudomonas,77種)、伯克霍爾德菌(Burkholderia)、黃單孢菌屬(Xanthomonas)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、食酸菌屬(Acidovorax)、根瘤菌屬(Rhizobium)等近200種植物致病菌，特別適合各農(nóng)業(yè)大學、研究所及相關機構進行植物病理分析和研究用。

第63頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG在食品工業(yè)應用及研究領域提供大量的數(shù)據(jù)庫，包括70多種乳酸菌、30多種雙歧桿菌及各類常見的食品必檢的致病菌數(shù)據(jù)庫，包括沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌(含阪崎腸桿菌)、葡萄球菌、彎曲菌、假單胞菌、弧菌、梭菌、志賀氏菌等，用于食品、藥品及化妝品行業(yè)用于致病微生物鑒定、工業(yè)應用微生物研究、質量控制及產(chǎn)品研發(fā)等。第64頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月BIOLOG專門分開提供一個DP(危險微生物)數(shù)據(jù)庫，包含鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌、馬爾他布魯氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽假單孢菌)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌、蘇云金芽孢桿菌、假結核耶爾森氏菌、蠟樣芽胞桿菌等12種強致病微生物，適用于國家疾病控制中心、國家安全機構及軍事機構用于生物武器檢測及防治研究。目前廣泛用于美國軍方進行生物恐怖檢測及預防研究。第65頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鑒定初始首先按常規(guī)微生物操作方法分離出純種。第66頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月鑒定步驟如下：

第一步

用Biolog專用培養(yǎng)基將純種擴大培養(yǎng)。

第二步

按要求配制一定濁度(細胞濃度)的菌懸液。

第三步

將菌懸液接種至微孔鑒定板(Microplate)，培養(yǎng)一定時間。

第四步

將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，軟件自動給出鑒定結果。第67頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第69頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月植物病原細菌檢測和細菌病害診斷方法第71頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月一、癥狀特征第72頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第73頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第74頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第75頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月十字花科軟腐病第76頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月瓜萎蔫病第77頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤第78頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

由細菌侵染所致病害的病部，無論是維管束系統(tǒng)受害的，還是薄壁組織受害的，都可以在徒手切片中看到有大量細菌從病部噴出，這種現(xiàn)象稱為菌溢現(xiàn)象(bacteriaexudation，BE)。菌溢現(xiàn)象為細菌病害特有，是區(qū)分細菌病害或真菌、病毒病害的最簡便的手段之一。二、顯微鏡檢查（菌溢現(xiàn)象）第79頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌溢現(xiàn)象操作方法細菌病害的病組織，內含有大量菌體，可通過菌溢現(xiàn)象或診斷，具體方法：①取病健組織交界部位一小塊，置于截玻片上。②加一滴無菌水后，加蓋玻片。③低倍鏡下，暗光，觀察。④可看到病斑切口處有大量細菌云霧狀涌出。第80頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月菌溢現(xiàn)象第81頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月1、凝集反應

顆粒性抗原如細菌與其特異性抗體在電解質影響下，很快結合成可見的凝集塊。

載玻片凝集反應是最快速的測定方法：在清潔載玻片上加兩滴生理鹽水配的菌懸液，用移植環(huán)取少量抗血清與其中一滴菌懸液混合，另一滴不加血清作為對照。經(jīng)3~5分鐘，可以看到原來均勻懸浮的細菌凝集成團，對照則不發(fā)生這種變化。另一種常用方法是試管凝集反應，雖然沒有玻片凝集反應快捷，但能測定血清效價和作定量研究。

分子生物學檢測技術第83頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月2、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzymelinkedimmunesorbentassay,ELISA）

該方法是將微量的酶與測定的抗原或抗體結合，大大的提高抗原和抗體反應的靈敏度?？贵w夾心ELISA法通常比其他ELISA方法敏感2－5倍。先用抗體包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加測定抗原樣本，抗原被抗體吸附，然后將酶聯(lián)抗體加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而顯色，用分光光度計檢測。

第84頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第86頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第87頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月4、核酸雜交及PCR診斷技術

第88頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用核酸鏈間堿基配對––––核酸雜交來識別特定核酸順序的方法。將一個預先分離純化或合成的已知核酸序列片段，加以標記，就成為核酸探針(probe)。用核酸探針可以探測待查標本核酸中與探針具有互補的堿基順序。如果兩者有互補順序則雜交成功,結果陽性;若待查標本核酸與探針順序無關則雜交失敗,結果呈陰性。由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA,其探針為互補DNA(complementaryDNA,cDNA)，稱為cDNA探針。4.1核酸雜交第89頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸雜交第90頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月4.2PCR診斷技術聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction,PCR）是一種體外擴增特異性DNA的技術，在短時間內可以大量擴增核酸。整個擴增包括3個重復的步驟：（1）DNA熱變性，雙鏈變單鏈；（2）引物退火，當溫度降低時，兩個引物分別結合到靶DNA的兩條鏈的3'末端，（3）引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物由5'3'擴增延長。分別和相對的DNA鏈互補。第91頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第92頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第93頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月Real-timefluorescentPCRREP-PCRImmuno-PCRRAPD-PCRNested-PCR

在植物病原細菌檢測和鑒定中應用的PCR技術第94頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、分離培養(yǎng)與致病性測定

培養(yǎng)基稀釋法或劃線法培養(yǎng)。觀察單個菌落特點。將分離的細菌接種于寄主植物或過敏性發(fā)應植物，觀察所得癥狀，從而完成柯赫氏法則的診斷程序。第95頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、鏈霉素防治

植物病原細菌對鏈霉素敏感，可用于防治細菌病害。第96頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月三、植物病原細菌的主要類群及分類地位五界生物分類系統(tǒng)，細菌屬于原核生物界。參考：《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊》第97頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月第98頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月四、主要屬

長期以來，植物病原細菌僅限于5個屬：

土壤桿菌屬（Agrobacterium）歐氏桿菌屬（Erwinia）假單胞桿菌屬（Pseudomonas）

黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）棒形桿菌屬（Clavibacter）第99頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月五屬細菌分類檢索表A.革蘭氏染色陽性，一般不能游動……棒形桿菌屬（Clavibacter）AA.革蘭氏染色陰性，能游動。

B.鞭毛極生

C.鞭毛一般多條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水溶性黃綠色或藍綠色色素……假單胞桿菌屬（Pseudomonas）

CC.鞭毛一般單條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生非水溶性色素……黃假胞桿菌屬（Xanthomonas）

BB.鞭毛周生

C.鞭毛1–4條，引起腫瘤……土壤桿菌屬（Agrobacterium）

CC.鞭毛多條，引致腐爛或萎蔫………………歐氏桿菌屬（Erwinia）第100頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月供試菌株革蘭氏反應陽性桿菌或球菌形成絲狀細胞Streptomyces（鏈霉菌屬）形成芽孢36℃生長，在7％NaCl中生長Curtobacterium短小桿菌屬尿酶Rhodococcus紅球菌屬Clavibacter棒形桿菌屬革蘭氏反應陰性不形成芽孢Bacillus芽孢桿菌屬；Clostridium梭狀芽孢桿菌屬+-+-植物病原細菌主要屬簡要檢查方法第101頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月好氧性或不活潑性滑行運動，在瓊脂平板上鋪開生長，短或長桿形彎曲、氧化酶陽性以鞭毛游動在King‘sB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素發(fā)酵性Cytophaga噬胞菌屬；Flexibacter屈橈桿菌屬+-革蘭氏反應陰性不運動，菌落光滑短桿狀、氧化酶陰性Flavobacterium黃桿菌屬溶果膠活性+-Erwinia（軟腐組群）Erwinia（不溶果膠組群）Pseudomonas（無熒光組群）在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂上為白色菌落，周鞭，致瘤Agrobacterium土壤桿菌屬Xanthomonas黃單胞菌屬在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂上為黃色菌落，單極鞭Pseudomonas（熒光組群）第102頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月有益細菌的利用研究第103頁，課件共115頁，創(chuàng)作于2023年2月生物防治

利用其他對植物無害的生物來影響或抑制病原物的生存和活動，從而降低病害的發(fā)生率或嚴重度。（1）抗菌作用(antibiosis)（2）溶菌作用(lysis)（3）競爭作用(com