上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓班 分子病理技術及質量控制 3.24何妙俠

分子病理檢測技術及其質量控制Pathological

change第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院病理科何妙俠主講內容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術PCR檢測技術的質控主講內容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術PCR檢測技術的質控DNA的發(fā)現分子病理學免疫病理學免疫學和標記技術超微病理學細胞病理學電鏡1858-AD體液器官病理學460-377-BC分子病理時代是必然趨勢組織學/細胞學IHC/ICC原位雜交技術基于PCR技術的檢測大體檢查現代病理學診斷形態(tài)學、免疫組織化學和分子診斷的綜合性診斷靶向藥物要求對腫瘤進行分子分型組織學驅動性突變NSCLC

的分群治療Non-squamousSquamousSquamousSquamousAdenocarcinoma2010EGFR

MuEGFR

WTNCCN2012Squamous-cellcarcinomaOthernon-squamousWTEGFR

Mu

ALK+

KRAS

MuNCCNNo

mutation

detectedKRAS

(22%)EGFR(17%)EML4-ALK

(4-7%)Double

mutants

(3%)RETMEK1Large

cell

carcinomaMET

AMPHER2PIK3CANCCNGuidelines

Version

2.2013

of

Non-Small

Cell

LungCancerHorn

L,PaoW.

J

Clin

Oncol.2009;26:4232–4235.BRAF(2%)ROS1部分常規(guī)靶向治療預測指標的檢測項目靶向治療靶點腫瘤類型antibodiesTrastuzumabRituximab乳腺癌（BC）B細胞淋巴瘤HER-2CD20結直腸癌（CRC）CetuximabBevacizumabPanitumumabsmall

moleculeinhibitorsImatinibEGFR/KRASVEGFBreastCa/CRC/非小細胞肺癌（NSCLC）EGFRCRCc-kit/

BCR-ABLEGFRGIST/CML肺癌GefitinibErlotinibEGFRNSCLC/胰腺癌LapatinibHer-2

&EGFRVEGFRs/

PDGFR/RAFVEGFRs/

PDGFR/RETBC肝細胞肝癌（HCC）/腎細胞癌（RCC）SorafenibSunitinibRCC

&GISTTensirulimus/EverolimusBortezomibmTORRCC多發(fā)性骨髓瘤和套細胞淋巴瘤Proteasome皮膚T細胞淋巴瘤VorinostatBortezomibHDACQuek,Yan,Yong

and

Salto-Tellez.Personalized

Medicine（2009）

6(5),465-468分子病理學開啟個體化治療新時代的金鑰匙Pathological

change分子病理時代主講內容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術PCR檢測技術的質控常用分子病理檢測技術

免疫組化

原位雜交

PCR擴增常用分子病理檢測技術

免疫組化

原位雜交

PCR擴增常用分子病理檢測技術

免疫組化

組織適當固定

切片的質量

抗原修復

去除非特異性背景

抗體的質量與稀釋

孵育時間

充分洗滌

適當顯色

設立陽性與陰性對照

正確判讀結果ERcerbB2常用分子病理檢測技術

免疫組化原位雜交PCR擴增石蠟包埋組織FISH檢測

3-5μm切片

涂膠白片

取材位置

乳腺Ca:EBC優(yōu)選原位癌/MBC優(yōu)選轉移灶活檢樣本

胃Ca：手術切除標本（6-8個高質量、有代表性的樣本最為理想）FISH第一天操作流程1、從石蠟包埋的癌組織中獲取多塊4μm切片，分別置于涂膠白片上2、將玻片置于65℃烤箱內烘烤2小時以上3、將玻片浸入二甲苯中脫蠟各2次，每次10分鐘4、將玻片浸入100%乙醇中5分鐘5、將玻片依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各3分鐘復水6、將玻片浸入去離子水（pH=7.0-7.2）中5分鐘7、將玻片浸入放有去離子水的考普林瓶中，95℃水浴25分鐘8、取0.4ml蛋白酶K儲存液（20mg/ml）溶于40ml

2×SSC(pH7.0-7.2)得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)FISH第一天操作流程9、將玻片浸入蛋白酶K工作液中，37℃下消化10分鐘10、玻片經蛋白酶K消化后，于2×SSC溶液中漂洗1次，10分鐘11、將漂洗完的玻片浸入含2.5%甲醛的PBS緩沖液中10分鐘12、將玻片依次浸入70%乙醇和100%乙醇中各3分鐘脫水13、自然干燥玻片14、將8μl雜交緩沖液和2μl探針加入到EP管中15、將10μl的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域即加蓋玻片，用封片膠封邊16、避免蓋玻片與玻片之間產生氣泡，待封片膠干燥后，檢查有無封嚴17、將玻片置于82℃的熱臺上，變性8分鐘18、變性完之后，將玻片移至濕盒中，42℃保溫過夜，待第二天洗片FISH第二天操作流程1、去掉封片膠，移去蓋玻片，立即將玻片浸入46℃水浴鍋中的2×SSC溶液中，晃動玻片3秒鐘，5分鐘后取出玻片2、將玻片浸入46℃水浴鍋中盛有2×SSC/50%甲酰胺溶液的瓶中，晃動玻片3秒鐘，4分鐘后取出玻片3、再將玻片浸入另一瓶46℃水浴鍋中的2×SSC溶液中漂洗1次,3分鐘后取出玻片4、將玻片浸入在70%乙醇和100%乙醇中各3分鐘后取出玻片5、暗處自然干燥玻片6、將10μlDAPI復染劑滴加于雜交區(qū)域位置，立即蓋上蓋玻片7、置暗處10-20分鐘后，在熒光顯微鏡下選用合適的濾波片觀察FISH實驗主要存在問題

脫蠟不完全徹底

抗原修復不徹底

消化控制不良

背景緩沖試劑配置沒到中性

雜交變性溫度及過夜?jié)穸炔磺‘?/p>

洗片不到位

結果判斷不標準43/F

乳腺癌IHCC-erbB-2

+++FISH

陽性HER-2

成簇擴增

重疊的細胞，盡量回避，不去計數。

若癌區(qū)很少，不得不計數時，重疊區(qū)域內的信號只計數一次。

兩信號點中還能加入一個相同大小的信號點，判讀為2個信號點

兩信號點中無法加入一個相同大小的信號點，判讀為分裂型的1個信號點

信號點呈條帶狀，只要中間不斷開，判讀為1個信號點。常用分子病理檢測技術

免疫組化

原位雜交PCR擴增常用分子病理檢測技術

PCR擴增

DNA提取

PCR擴增

PCR產物鑒定石蠟組織DNA的提取?

切

片1

10μm石蠟切片6-10張置于1.5ml

EP管中或貼于干凈載玻片上2

切片時盡量根據相應蠟塊的形態(tài)學選取腫瘤組織去掉周圍非腫瘤組織

，適當烤片?

脫蠟至水1

1200μl二甲苯，混勻，37℃，5min

，9000rpm離心，10min，小心吸棄二甲苯，重復1-2次2

1200μl無水乙醇，混勻，9000rpm離心，10min，小心吸棄乙醇，重復1-2次3

置于37℃EP管開蓋，干燥2-3小時，如用載玻片就常規(guī)脫蠟至水用干凈切片刀刮下組織放入EP管中，同法干燥石蠟組織DNA的提取?

備

注若臨床提供標本為外周血或骨髓，均應加抗凝劑，低速離心小于1000轉/min

離心5min；然后加入淋巴細胞分離液，常規(guī)分離淋巴細胞，低速離心15min，吸取淋巴細胞，再加直接加裂解液和蛋白酶K提取Tiangen基因組DNA抽提試劑盒?

消

化1

加入GA溶液，和蛋白酶

K(20

mg/ml)

20μl2

55℃過夜，至組織完全透明清澈，其間可根據組織大小分步適量再加5-10μl蛋白酶K，并間歇震蕩3

加入200ulGB溶液，

70℃震蕩混勻10min，使溶液變清亮，加入200ul無水乙醇，震蕩混勻?

DNA抽提1

倒入收集管的吸附柱中，12000

rpm,

離心

30s，棄廢液2

吸附柱中加入500ul

GD溶液，12000rpm,

離心

30s，棄廢液3

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

離心

30s，棄廢液4

吸附柱中加入500ul

PW溶液，12000rpm,

離心

2min，棄廢液5

12000

rpm,

離心

2min，棄廢液，直至吸附柱管壁上無水珠Tiangen基因組DNA抽提試劑盒?

DNA洗脫1將吸附膜懸空，滴加50ul

TE洗脫液，室溫靜置5min2

12000rpm,離心

2min，收集洗脫液3將洗脫液反復加入吸附柱中，靜置5min，12000rpm,離心

2min，收集洗脫液，-20℃冰箱保存?

DNA測定1

取5μl樣本DNA，以TE緩沖液稀釋100倍，用紫外分光光度計測定DNA濃度及OD值(260

nm/280nm)2

OD值(260nm/280nm)在1.8~2.0之間為妥3取1μl樣本DNA，用1.5-2%瓊脂糖凝膠電泳4-20℃冰箱保存PCR擴增?

PCR反應體系模板DNA

2.0

ul(1ug)2×Taq

PCRMasterMix

12.5

ulPrimer

1（10

uM）

1.0ulPrimer

2（10

uM）

1.0ulddH2O5.5ul總體積25.0

ul?

PCR反應循環(huán)預變性

94℃變性

94℃復性

55℃延伸

72℃充分延伸72℃5min1min45s1min10min35cyclePCR擴增?

PCR反應完成后處理95℃

5min4℃

1h然后4℃保存?

目

的去除異源雙鏈聚合物去除引物二聚體PCR產物鑒定?

配制TAE電泳緩沖液，一般為0.5%?

配制瓊脂糖凝膠，一般為1.5-2%?

電泳板上鋪膠，注意點樣孔?

點樣，

注意操作瓊脂糖凝?

電泳，

約30分鐘膠

?

注意觀察不能跑出膠外，

達膠的2/3處即可電

?

紫外燈掃描系統(tǒng)掃描觀察結果泳

?

成像法?

注意非特異性條帶的干擾?

陽性對照與空白對照PCR擴增注意事項

PCR擴增

組織適當固定

徹底脫蠟

完全消化

DNA濃度與質量控制

反應體系濃度

擴增條件

去除非特異性結合

正確的凝膠電泳

設立陽性與陰性對照

正確判讀結果PCR擴增技術延伸

PCR擴增

PCR擴增--毛細管電泳

PCR擴增--片段分析與測序

PCR擴增--直接測序

qPCR-HRM法PCR擴增-毛細管電泳檢測PCR擴增-片段分析與測序

PCR擴增?

片段分析將整個DNA作為一個整體進行分析?

測序分析分析DNA序列的堿基順序，是否發(fā)生改變應用毛細管電泳片段分析PCR擴增直接測序的應用

適用：點突變小片段缺失插入突變

臨床應用：胃腸道間質瘤

KIT

PDGFRA突變結直腸癌

KRAS

BRAF突變乳腺癌

EGFR

KRAS突變胃腸道間質瘤相關檢測Real-Time

PCR

擴增技術

Real-Time

PCR擴增PCR反應體系中加入熒光探針實時監(jiān)測整個PCR過程定量和定性分析包括

TaqMan法ARMS法

Real-Time

PCR熒光探針非特異性探針SYBR

Green特異性探針TaqMan

探針蝎形探針環(huán)形探針ARMS法結果判讀主講內容分子病理的發(fā)展常用分子病理技術PCR擴增檢測的質控分子病理診斷的質量控制

專門的PCR認證實驗室

經過培訓的技術人員上崗

有資質的病理醫(yī)師簽發(fā)報告

標本質量過關

操作環(huán)節(jié)嚴格質控

結果判讀標準化PCR擴增檢測的質量控制標本質量過關

操作環(huán)節(jié)嚴格質控

結果判讀標準化PCR擴增檢測的質量控制標本質量過關

穿刺組織

新鮮組織

福爾馬林固定石蠟包埋組織

血液

體液

骨髓液適用于突變檢測的標本建議采用靈敏度RMS檢測病理評估合格的標本適用基因突變病理學評估確認腫瘤細胞數大于100組織學觀察標本接收、固定組織處理、石蠟包埋切片及H&E染色

標本通常較大，能提供足夠的腫瘤組織用于檢測

標本可以是冰凍或福爾馬林固定組織支氣管鏡和細針穿刺活檢標本

標本較小

通常是福爾馬林固定、石蠟包埋處理

建議采用靈敏度高的ARMS檢測方法細胞學標本涂片、染色液基細胞學病理診斷病理診斷病理診斷胸水或支氣管刷片或痰液細胞蠟塊，切片染色

細胞學標本中通常腫瘤細胞數目較少，需要采用靈敏度高的ARMS檢測方法

建議有條件的病理科制備細胞蠟塊：

處理流程：細胞學標本經離心處理后，常規(guī)福爾馬林固定、處理及石蠟包埋即可

制備細胞蠟塊的好處：(1)便于長期保存(2)便于基因突變的檢測及其他分子生物學標記物的檢測標本的病理評估內容

診斷：確保腫瘤組織是非小細胞性肺癌（以肺癌為例）

腫瘤組織量：確保有足夠的腫瘤組織用于突變檢測

盡量保證200-400個腫瘤細胞對于技術成熟的實驗室，可嘗試進行＜200個腫瘤細胞標本檢測

5-10uM

10張切片能滿足突變檢測需求當細胞數較少時,可以適當增加切片數,以滿足檢測需求

腫瘤比例：標識腫瘤豐富的區(qū)域，提高腫瘤細胞比例用于檢測

盡量去除非腫瘤組織及細胞，提高檢測的敏感性

不同敏感性的檢測方法對腫瘤比例要求不一樣測序法：＞10%ARMS法：＞1%肺癌的分類與基因突變的關系

貼壁為主型、乳頭為主型、和腺泡為主型腺癌預后較好，EGFR基因突變率高

K-ras基因突變最常見于浸潤性粘液腺癌和實體為主性腺癌

ALK融合基因最常見于含有印戒細胞的腺癌，以及腺泡型、乳頭型、篩狀和產生黏液的腺癌PCR擴增檢測的質量控制

標本質量過關操作環(huán)節(jié)嚴格質控

結果判讀標準化操作環(huán)節(jié)嚴格質控第一步

DNA提取第二步

加樣上機第三步

結果判定陽性對照陽性對照突變信號不含突變的曲線圖含突變的曲線圖DNA的質量控制標本質量過關

切片量適宜

切片時每個標本間更換刀片

切片時戴手套

脫蠟徹底干凈

嚴格控制樣品間交叉污染DNA的質量控制常用DNA質控方法對比DNA評估參數方法適用DNA來源全部DNA可擴增

DNADNA

純度Spectrophotometry分光光度計冰凍新鮮組織、全血、細胞系√X√Fluorimetry(eg.Picogreen)熒光染料冰凍新鮮組織、全血、細胞系√XXFFPE組織、血漿、血清以及其他來源高度降解DNAX√qPCRqPCR法定量的優(yōu)點：排除DNA質量不符合要求樣品，節(jié)省成本、時間

分光光度計（260nm處光密度值）和熒光染料法檢測總DNA量

優(yōu)點：簡便缺點：無法評估可擴增的DNA片段和PCR抑制劑紫外分光光度計法

熒光定量PCR只檢測可擴增的DNA片段的量，并評估是否有PCR抑制劑優(yōu)點：FFPE來源DNA的最可靠，排除DNA質量不符合要求的樣本（節(jié)省成本，時間）缺點：增加了檢測所用時間，增加成本PCR

產物長度可擴增DNADNA

10倍稀釋后加樣操作注意事項正確操作錯誤操作槍尖不可伸入到封蓋劑之下槍尖靠在管口伸入5mm處加入樣品設定閾值閾值線使用軟件自動設定的閾值，根據實際情況調節(jié)閾值設定在背景熒光信號之上，擴增曲線的指數期之內（LOG曲線下，背景熒光與平臺期兩者中間）設立陰性對照和陽性對照

陰性對照應無FAM熒光信號產生

陽性對照FAM和VIC信號均應升起，陽性質控品的Ct值一般小于20，但可能會由于不同儀器的不同閾值設置而發(fā)生波動設立樣本外控

待測樣本的外控應有FAM信號石蠟包埋組織切片樣品，則15

≤

Ct值≤

21非石蠟切片樣品，則13

≤

Ct值≤

19外控Ct值可能原因解決方法石蠟包埋組織樣品，Ct＜15；非石蠟切片樣品，Ct＜13。加入DNA過量稀釋DNADNA含有抑制劑DNA量加入不夠稀釋或重新抽提DNA增加DNA用量石蠟包埋組織樣品，Ct＞21；非石蠟切片樣品，Ct＞19。設立樣本內控

待測樣本的內控(1-7號管的HEX信號曲線)應有擴增曲線1.

HEX有信號，FAM無信號

——質控通過2.

HEX無信號，FAM有信號

——質控通過3.

任何一管HEX，FAM均無信號—質控不通過（該樣品數據無效）可能原因解決方法樣品DNA中存在PCR抑制劑稀釋或重新抽提DNADNA量加入不夠加樣時漏加DNA增加DNA用量重新檢測PCR擴增檢測的質量控制

標本質量過關

操作環(huán)節(jié)嚴格質控結果判讀標準化結果判讀標準化

同時選擇同一號管的陽性對照、陰性對照和樣品的擴增曲線

選定閾值線，判讀Ct值陽性樣品陽性對照陽性樣品陰性樣品基因檢測報告標準模板

患者基本信息

基因檢測結果和結論

檢測方法和試劑

被檢標本來源與部位

基本病理學狀態(tài)；

標本種類與名稱

腫瘤細胞數量；腫瘤細胞數所占比例等

DNA的質控結果

由病理醫(yī)生簽發(fā)備注：該檢測結果僅對本次送檢標本負責ARMS法ARMS

突變檢測稀釋DNA樣品濃度到2-3ng/ul配制樣品DN