干化學技術與應用

干化學技術與應用干化學技術與應用/NUMPAGES13干化學技術與應用干化學技術與應用干化學技術與應用所謂“干化學”是與傳統(tǒng)的“濕化學”（即溶液化學）相對比較而言的。它是以被檢測樣品中的液體作為反應媒介，待測物直接與固化于載體上的干粉試劑反應的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學的最大區(qū)別就在于參與化學反應的媒介不同。隨著生物化學中酶的分離、提純、存儲等技術的發(fā)展，傳感器、光度計和電極技術的進步，以及計算機應用的普及，干化學技術在近20年里得到了長足的進步，相對于“濕化學”，“干化學”具有如下優(yōu)點：

干化學試劑載體的結構干化學試劑載體的結構分為二層結構，三層結構，和多層膜。

最簡單的二層結構

用于生化分析的試劑載體最簡單的是二層結構，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素片中預固相了全部試劑。常見的是尿生化分析試劑條：

尿液中的待測成分與預固相在纖維素片上的試劑直接反應，通過反射光度計測定其顏色的改變，從而計算待測成份的濃度。這種機構只能對待測成分進行定性或半定量測定，這樣就限制了它在其它須準確定量的標本的應用。稍加改進的三層結構

在試劑層上加一多孔膠膜過濾層，其作用是將樣品中的雜質(zhì)過濾掉，并起保護試劑層作用。常見的是微量法測定葡萄糖的試劑條。

三層試劑載體的測定光路是通過透明的塑料基片，而不經(jīng)過最上面的過濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測成分測定的穩(wěn)定性和準確性。比較完善的多層膜

當代臨床檢驗中的干化學法，最具代表性的就是多層膜法，即干化學的多層膜試劑載體。它集現(xiàn)代化學、光學、酶工程學、化學計量學和計算機技術于一體。

多層膜分為三種類型：比色/速率法干片、離子法干片和免疫速率法干片1.1

介紹比色/速率法干片

比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化項目的測定，干片模式圖(圖1)顯示了一個臨床化學比色/速率法干片模式簡圖。在這個試劑片中，多種反應試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴散層，然后被夾在一個塑料結構中。如圖所示，共有4個功能層：擴散層、試劑層、指示劑層和支持層。每個試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的顏色深淺與待測物濃度成正比。

擴散層：擴散層的概念最早是由柯達研究實驗室EdwinPrzybylowic博士提出的，是由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.5－30微米之間。擴散層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。擴散層的中空體積占40%－90%，這種毛細網(wǎng)狀結構能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細作用將樣品迅速吸入多空擴散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因為凝膠層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。

擴散層不僅可阻留細胞，結晶和其他小顆粒，它也可以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質(zhì)等滯留。當待檢樣品通過擴散層后，可以消除溶液中影響檢測反應干擾物質(zhì)。擴散層中的TiO2和

BaSO4.一方面可用來掩蓋待檢樣品中的有色物質(zhì)，使反射光度計的測定結果不受影響，同時這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特定試劑片中，擴散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟動某種反應的物質(zhì)，以提高分析的特異性。

試劑層：在化學試劑層中，根據(jù)實際測定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個功能試劑層組成。反應區(qū)的功能是將待測物通過物理、化學或生物酶學等反應轉(zhuǎn)化為可與顯色劑結合的化合物。試劑層中按照反應的順序涂布了不同的化學試劑，使反應按照預先的設定依次進行。針對不同檢測項目的個性化設計為化學反應提供了最理想的物理和化學反應環(huán)境－這就是為什么干化學技術能夠確保更準確的試驗結果。尿酸干片是使用清除劑層的一個示例。清除劑層含有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸（維生素C）（一種內(nèi)源性干擾物）轉(zhuǎn)化，對試劑層中所發(fā)生反應不產(chǎn)生干擾。

指示劑層：反應底物進入指示劑層，在這里發(fā)生顯色反應。此層包含染料或相似的指示劑，使反應產(chǎn)物到達指示劑層后生成了有色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測。

支持層：此層是透明塑料制成，起到支持其它層的作用，且允許光線百分之百透射，以便對有色復合物進行測量。

顏色變化通過反射光檢測，由于光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而避免了對檢測結果的干擾。因為多層的設計，不同的項目加入了特殊的試劑層增強反應的特異性，干化學具有優(yōu)異的抗干擾能力。結合非結合膽紅素(BuBc)干片是使用屏蔽層的一個示例。屏蔽層可有效阻隔可能的干擾成分（例如，血紅蛋白）以防其進入擴散層，從而防止它們影響測量結果。

1.2

直接選擇性電極離子檢測干片

離子（鈉，鉀，氯）檢測是干化學檢測項目中的傳統(tǒng)優(yōu)勢項目，采用離子法干片。其設計采用直接電勢法，樣本無需稀釋。離子干片是由紙橋?qū)蓚€離子選擇性電極相連，通過電壓表來測量患者樣本和已知參比液之間的電勢差，從而計算出鈉，鉀，氯的離子濃度。

1.3

免疫速率法干片

免疫速率法干片主要用于進行藥物濃度和蛋白質(zhì)檢測，分為競爭法和非競爭性干片兩類。

I.

競爭法（例如地高辛）

讀數(shù)時采用了多點速率法來檢測分析物濃度。分析物與酶標抗原競爭有限數(shù)量的抗體結合位點。加入含底物的免疫洗液，一方面洗去未結合物質(zhì)，另一方面抗原抗體復合物與無色底物反應顯色以670nm波長加入免疫洗液并孵育2.5min后讀數(shù)；通過速率的變化采計算分析物濃度，發(fā)射光密度與分析物濃度成反比。

II.

非競爭法（CRP）

讀數(shù)時采用定點速率法。待測物與固相抗體、酶標抗體形成夾心“三明治”。加入含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結合物質(zhì)，抗原抗體結合物與底物反應顯色，孵育2.5分鐘時讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測物濃度成正比。

1

反射光度法的原理――干化學分析法的理論基礎

反射光度法依據(jù)反射介質(zhì)不同，有多種理論。光線進入介質(zhì)后出現(xiàn)下列效應：

－在照射表面產(chǎn)生反射（和折射）

－內(nèi)部吸收

－在內(nèi)部或照射表面產(chǎn)生散射

這些效應的總和決定了光再離開介質(zhì)的比率和方向。反射光密度與分析物濃度不呈線性關系的原因是檢測到的光信號包含了反射光和散射光。光通過各層干片時，干片內(nèi)部各個層和表面會產(chǎn)生散射和反射。

檢測比色/速率和免疫速率法干片時采用的是反射分光光度法。強生干化學技術反射光理論是Williams,Clapper等提出的。在儀器內(nèi)部光源發(fā)出一束光透過透明支持層，在試劑層光被有色化合物部分吸收后，在擴散層提供的反射面被反射，反射光經(jīng)濾光裝置后回到光度檢測器被讀數(shù)。光密度由此被轉(zhuǎn)化為電壓讀數(shù)，并計算成分析物濃度。

干化學技術中入射光（IO）100%進入干片。有色物質(zhì)吸收一定比例光后反射。反射法檢測反射光（IR），反射比為R=Ir/Io

反射光密度（DR）公式為DR=log10

反射法中，分析物濃度與DR不成比例關系。

C不等于Ao（截距）+A1（斜率）*DR

雖然不呈線性關系，但是結果仍然可以預測。嚴密的研究建立了患者標本濃度與反射光密度間的數(shù)學關系。通過一個函數(shù)就可完成二者間轉(zhuǎn)換。函數(shù)關系是使用前通過定標盤載入檢測系統(tǒng)，通過函數(shù)實現(xiàn)每種測試項目的轉(zhuǎn)換。通用定標模式

這是用來把儀器檢測光密度與分析物濃度建立關聯(lián)的通用公式。A0、A1、A2是未知的，需經(jīng)定標程序計算得出。g(DR)是將檢測光密度與分析物濃度關系線性化的轉(zhuǎn)化函數(shù)。K在每項測試中是已知常數(shù)。

將DR轉(zhuǎn)換成g(DR)，轉(zhuǎn)換函數(shù)是出廠時由大量該儀器反復研究得出的，確保了g(DR)與濃度呈線性關系。許多分析項目用了二條曲線來完成分析物濃度的轉(zhuǎn)換。

“DR”曲線及“函數(shù)轉(zhuǎn)換”曲線，二者在通過原點的直線上相交幾點可以看到二者呈鏡像關系。將它們疊加后，結果將全部落在直線上。正是引入“函數(shù)轉(zhuǎn)換”的目的。當然，此圖8只是為了便于理解而畫的比較規(guī)律，實際更為復雜。

函數(shù)轉(zhuǎn)換曲線與定標曲線是相對應的，當DR為1.0時則轉(zhuǎn)化為g(DR)校正讀數(shù)為1.3，當DR為0.6時，校正讀數(shù)應為0.4。

g(DR)與通用定標模式每個定標品的g(DR)值都定義在通用定標模式中，方程式A（圖9）

已知值和未知值定標中的已知值有：

C：三個是標品的已知濃度，是通過定標盤載入儀器的

DR：從干片測得

K：每種項目固定不變由定標載入

雖未知但可計算出，是定標參數(shù)：

A0=截距

A1=斜率

A2=曲率

通過廠家的設置和用戶端的定標操作，每個標本的結果就可以通過光信號值計算得到。

反射光的反射背景是擴散層，光線不通過已經(jīng)被阻留在擴散層上的潛在干擾物，從而避免了對檢測結果的干擾。這是擴散層承擔排除干擾的基礎。

由試劑片的結構和反射光檢測技術可見涂層技術相對于溶液化學分析技術具有很多優(yōu)點：在試劑片中化學反應可以在個別物理分層中進行，如圖所示，前一反應的產(chǎn)物可以繼續(xù)進入另一層進行其他化學反應，從而引導一個反應序列，因此在多層復合薄膜中的各層可以給出一種特定的環(huán)境用以完成某種特定的反應。這一點溶液化學分析是無法完成的，例如乳糜血的樣品，在進行溶液方式生化分析時，就需要先脫脂，然后進行分析，而利用多層復合膜技術，即可在一個薄膜上一次完成全部反應，明顯提高了分析的特異性。同時由于沒有溶液對待檢樣品的稀釋作用，所以本方法也可大大提高了檢測的靈敏度。這種能夠?qū)嵤讉€連續(xù)的物理和或化學反應而無需操作者介入的方法，就像計算機領域中廣泛應用的芯片技術，可以使繁雜的實驗室儀器設備和各種器皿聯(lián)合完成的工作固化在一個多層復合薄膜上，極大的簡化了操作和提高重復性及穩(wěn)定性。因此，在短短的十幾年時間里，干化學技術即在世界各臨床化學實驗室廣為應用。