生物制藥工藝學(xué)1

生物制藥工藝學(xué)1第一頁，共33頁。生物制藥工藝學(xué)第一篇生物藥物發(fā)酵工藝微生物代謝產(chǎn)物：次級代謝產(chǎn)物菌種：選育、育種、保藏、培養(yǎng)基、滅菌除菌、生產(chǎn)種子、發(fā)酵過程與控制、基因工程菌、生物催化第二篇生物藥物分離純化工藝生物藥物純化技術(shù)：液固分離、膜分離、萃取、離子交換、吸附分離、沉淀分離、色譜、結(jié)晶第二頁，共33頁。1緒論一、生物制藥的發(fā)展歷史1929年Fleming青霉素菌株：點(diǎn)青霉1940年Florey和Chain結(jié)晶青霉素20世紀(jì)40-50年代抗生素工業(yè)發(fā)展黃金時代20世紀(jì)60年代以來，抗腫瘤、抗病毒、抗蟲抗生素20世紀(jì)80年代以后，基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程第三頁，共33頁。第一章緒論二、生物制藥工藝的改進(jìn)與創(chuàng)新（一）微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展：表面培養(yǎng)到深層培養(yǎng)、補(bǔ)料發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、高密度發(fā)酵（二）發(fā)酵控制技術(shù)的發(fā)展：發(fā)酵控制（三）生物反應(yīng)器制造技術(shù)的發(fā)展：高效率低能耗生物大容量反應(yīng)器，發(fā)酵罐技術(shù)發(fā)展（四）分離純化技術(shù)的發(fā)展：各種分離理論及分離技術(shù)的開發(fā)第四頁，共33頁。第一章緒論三、生物制藥產(chǎn)品的類別（一）微生物發(fā)酵產(chǎn)物：1.菌體藥物，酵母菌體、單細(xì)胞蛋白，人工培養(yǎng)真菌如靈芝、茯苓菌、香菇、猴頭菇等、蘇云金芽孢桿菌；2.微生物酶制劑：各類酶3.酶活調(diào)節(jié)劑：酶的抑制劑和激活劑4.微生物代謝產(chǎn)物：初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物第五頁，共33頁。第一章緒論三、生物制藥產(chǎn)品的類別（二）生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：利用生物代謝過程中的酶或酶體系將底物轉(zhuǎn)化成含有特殊功能團(tuán)的產(chǎn)物（三）基因工程產(chǎn)物：1982年，第一個基因工程藥物胰島素上市，此外陸續(xù)上市的有人生長因子、白介素、干擾素、促紅細(xì)胞生成素等。第六頁，共33頁。第一章緒論四、生物制藥的工藝過程（一）菌種（二）斜面培養(yǎng)（三）種子制備（四）發(fā)酵（五）發(fā)酵液預(yù)處理（六）提取和精制（七）成品檢驗(yàn)（八）成品包裝第七頁，共33頁。2微生物代謝產(chǎn)物生物合成與調(diào)控2.1微生物的代謝產(chǎn)物2.1.1初級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn)2.1.2次級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn)2.1.3初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物的關(guān)系第八頁，共33頁。2.1.1初級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn)初級代謝產(chǎn)物指的是與微生物的生長繁殖有密切關(guān)系的代謝產(chǎn)物，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸、多糖、脂肪酸、維生素等特點(diǎn)：（1）是菌體生長繁殖所必須的物質(zhì)（2）是各種微生物共有的產(chǎn)物第九頁，共33頁。2.1.2次級代謝產(chǎn)物及其特點(diǎn)次級代謝產(chǎn)物指的是與生物的生長繁殖無直接關(guān)系的代謝產(chǎn)物，是某些生物為了避免初級代謝中間產(chǎn)物的過量積累或由于外界環(huán)境的脅迫，而產(chǎn)生的一類有利于其生存的代謝產(chǎn)物。特點(diǎn)：（1）特定菌種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物；（2）菌體特定生長階段的產(chǎn)物；（3）多組分的混合物第十頁，共33頁。2.1.3初級代謝產(chǎn)物與次級代謝產(chǎn)物的關(guān)系一、初級代謝產(chǎn)物是次級代謝產(chǎn)物的前體或起始物二、初級代謝的調(diào)控影響次級代謝產(chǎn)物的生物合成第十一頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物或其中間代謝產(chǎn)物為原料合成的，其構(gòu)建單位主要有：氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮體及其衍生物、甲羥戊酸衍生物、莽草酸及其衍生物、環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇、核苷衍生物等。次級代謝產(chǎn)物的生物合成涉及起始物，包括構(gòu)建單位的合成、構(gòu)建單位的連接和產(chǎn)物合成后的修飾過程。第十二頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑聚酮體及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短鏈脂肪酸縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，該反應(yīng)均由多酶復(fù)合體—聚酮合酶（PKS）催化。在縮合過程中小分子有機(jī)酸中的羧基被轉(zhuǎn)化為合成產(chǎn)物中的酮基，所以該合成途徑被稱為聚酮體或多聚乙酰途徑（polyketide）。聚酮體途徑的代表產(chǎn)物有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、多烯類抗生素、蒽環(huán)類抗生素、四環(huán)類抗生素等。聚酮體合成的起始單位有：乙酰輔酶A、丙酰輔酶A和丁酰輔酶A；而作為鏈的延長單位有丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶等，它們分別是二碳、三碳、四碳單位的供體。第十三頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.1氨基酸及其衍生物許多次級代謝產(chǎn)物是以氨基酸或氨基酸的衍生物為原料合成的。如多肽類抗生素基本上是由氨基酸及氨基酸的衍生物合成的。氨基酸及其衍生物包括天然氨基酸；非天然氨基酸如D-氨基酸、N-甲基氨基酸、β-氨基酸等。天然氨基酸合成的中間產(chǎn)物鳥氨酸和α-氨基己酸。代表產(chǎn)物主要是肽類抗生素。（見書中P16圖2-9）第十四頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.2糖及氨基糖次級代謝產(chǎn)物中有些糖的結(jié)構(gòu)是非常特殊的，他們在初級代謝產(chǎn)物中根本不存在，如構(gòu)成氨基糖苷類抗生素的碳霉糖、竹桃糖、鏈霉糖等，它們以O(shè)-、N-、S-、C-糖苷等與次級代謝產(chǎn)物分子中的糖苷配基連接。葡萄糖和戊糖是這些糖類和氨基糖的前體。葡糖糖的碳架一般經(jīng)過異構(gòu)化、氨基化、脫氧、碳原子重排、氧化還原或脫羧等反應(yīng)后形成各種糖類構(gòu)建單位。氨基糖的合成是先將葡萄糖活化成己酮糖，然后經(jīng)過轉(zhuǎn)氨作用將谷氨酰胺或谷氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到己酮糖的分子上。見書P16和P17的圖2-10和圖2-11.第十五頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.3聚酮體及其衍生物聚酮體及其衍生物是乙酸、丙酸、丁酸和某些短鏈脂肪酸縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。該反應(yīng)均由多酶復(fù)合體-聚酮合酶（polyketidesynthase,PKS）催化。在縮合過程中，小分子有機(jī)酸中的羧基被轉(zhuǎn)化為合成產(chǎn)物中的酮基，隨著小分子有機(jī)酸的不斷被縮合，合成產(chǎn)物的碳鏈不斷延長，合成產(chǎn)物中的酮基也逐漸增多——聚酮體或多聚乙酰途徑。聚酮體途徑的代表產(chǎn)物有大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、多烯類抗生素、蒽環(huán)類抗生素、四環(huán)類抗生素等。聚酮體合成的基本步驟見書P18圖2-13，圖2-15為聚酮體產(chǎn)物與脂肪酸的生物合成過程，圖2-16為聚酮體與脂肪酸生物合成示意圖。第十六頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.4甲羥戊酸及其衍生物甲羥戊酸（mevalonicacid,MVA）,即3-甲基-3,5-二羥基戊酸，是由乙酸縮合而成，P19圖2-17為甲羥戊酸的生物合成路徑。甲羥戊酸經(jīng)磷酸化、脫水和脫羧后形成具有生物活性的異戊二烯焦磷酸（C5單位）。異戊二烯焦磷酸幾乎可以任何數(shù)量的單元相結(jié)合，形成各種代謝產(chǎn)物（見P20圖2-18類胡蘿卜素和甾醇的生物合成途徑）第十七頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.5環(huán)多醇和氨基環(huán)多醇環(huán)多醇是一些帶有羥基的環(huán)碳化合物。氨基環(huán)多醇是環(huán)多醇分子中的一個或多個羥基被氨基取代的衍生物（見書P21圖2-20）。在氨基環(huán)多醇類抗生素（如鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等）中最常見的環(huán)多醇部分是由葡萄糖衍生出來的，如α-脫氧核糖、鏈霉胍都是由葡萄糖經(jīng)過磷酸化、環(huán)化等反應(yīng)形成環(huán)多醇，再經(jīng)過氨基化等反應(yīng)形成的（見書中P21圖2-21氨基環(huán)多醇的生物合成）。第十八頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.6堿基及其衍生物正常核酸嘌呤堿基和嘧啶堿基，或由合成核酸的嘌呤和嘧啶堿基經(jīng)過化學(xué)修飾而形成的非核酸嘌呤堿基和嘧啶堿基，均可作為核酸與核苷類藥物的構(gòu)建單位。如肌苷（inosine）是由次黃嘌呤與核糖結(jié)合而成的，又稱次黃嘌呤核苷。肌苷和肌苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)見書中P21圖2-22。嘌呤霉素和阿糖腺苷的轉(zhuǎn)化也都是通過生物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的。其中腺嘌呤核苷酸直接被產(chǎn)生菌作為前體并入到嘌呤霉素的分子中，阿糖腺苷是通過2’-羥基腺苷的差向異構(gòu)化合成的。第十九頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.7莽草酸及其衍生物莽草酸是許多芳香族化合物（包括芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚類化合物）的前體，源自葡萄糖。芳香族氨基酸合成時有一段相同的途徑叫莽草酸途徑。代表產(chǎn)物有利福霉素、綠膿菌素和新生霉素等（見P22圖2-24由芳香中間體合成的抗生素和其他代謝產(chǎn)物）利福霉素的芳香成分來自莽草酸；綠膿菌素的吩嗪骨架來自鄰氨基苯甲酸；新生霉素和黃青霉素的芳香部分來自酪氨酸；放線菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香環(huán)來自色氨酸。第二十頁，共33頁。2.2次級代謝產(chǎn)物的構(gòu)建單位與合成途徑2.2.8吩噁嗪酮吩噁嗪酮是構(gòu)成某些次級代謝產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)，如放線菌素的發(fā)色團(tuán)中就居于一個吩噁嗪酮的結(jié)構(gòu)。代表產(chǎn)物有放線菌素（書中P23圖2-25放線菌素）色氨酸和其他一些代謝物是吩噁嗪酮生物合成的前體，它們先形成4-甲基-3-羥基-鄰氨基苯甲酸（書中P23圖2-26），然后兩分子的4-甲基-3-羥基-鄰氨基苯甲酸在吩噁嗪酮合成酶的催化下被氧化脫水形成吩噁嗪酮（見書P23圖2-27吩噁嗪酮的生物合成）第二十一頁，共33頁。2.3.1構(gòu)建單位的合成次級代謝產(chǎn)物的合成首先是要合成各個構(gòu)建單位，構(gòu)建單位就好比蓋高樓大廈的磚、瓦、門、窗，有了這些基本材料才能蓋出各式各樣的大廈。同樣，有了生物合成的各種構(gòu)建單位，才能合成種類繁多的次級代謝產(chǎn)物。2.3次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程第二十二頁，共33頁。2.3.2構(gòu)建單位的連接構(gòu)建單位合成后，在合成酶、連接酶、脫水酶、氨基轉(zhuǎn)移酶等酶的作用下相互連接，形成次級代謝產(chǎn)物的基本框架。書中P24對青霉素、阿維菌素和鏈霉素的合成途徑進(jìn)行了簡單介紹。2.3次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程第二十三頁，共33頁。2.3.3母核合成后的修飾次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物或其中間代謝產(chǎn)物為原料合成的，不同的構(gòu)建單位合成后的母核結(jié)構(gòu)類型和生物活性也不同。一般次級代謝產(chǎn)物的母核結(jié)構(gòu)合成后，往往還不具有生物活性，還要經(jīng)過后修飾過程才能產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，這些后修飾的過程包括：氨基化、甲基化、酰基化、羥基化等。書中P24圖2-28由6-脫氧紅霉內(nèi)酯經(jīng)過后修飾合成紅霉素A的過程。2.3次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程第二十四頁，共33頁。微生物的生命活動是通過各種代謝途徑組成的網(wǎng)絡(luò)相互協(xié)調(diào)來維持的，每一條代謝途徑都是由一系列連續(xù)的酶促反應(yīng)構(gòu)成。微生物能嚴(yán)格控制代謝活動，使之有序地運(yùn)行，并能快速適應(yīng)環(huán)境，最經(jīng)濟(jì)地利用環(huán)境中的營養(yǎng)物。微生物對次級代謝活動的調(diào)控主要有兩種代謝調(diào)節(jié)方式：一種是酶合成的調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)酶的合成量，這是一種“粗調(diào)”；另一種是酶活力調(diào)節(jié)，即調(diào)節(jié)已有酶的活力，這是一種“細(xì)調(diào)”2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第二十五頁，共33頁。2.4.1酶合成的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)在底物或底物的結(jié)構(gòu)類似物的誘導(dǎo)下產(chǎn)生2.4.2反饋調(diào)節(jié)（一）自身代謝產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)（二）前體物的反饋調(diào)節(jié)（三）支路產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)2.4.3磷酸鹽調(diào)節(jié)在抗生素等多種次級代謝產(chǎn)物合成中，高濃度磷酸鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第二十六頁，共33頁。2.4.3磷酸鹽調(diào)節(jié)在抗生素等多種次級代謝產(chǎn)物合成中，高濃度磷酸鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，稱為磷酸鹽調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)機(jī)制一般可能有以下幾個方面：（1）磷酸鹽促進(jìn)初級代謝，抑制菌體的次級代謝；(2)磷酸鹽抑制次級代謝產(chǎn)物前體的生物合成；（3）磷酸鹽抑制磷酸酯酶的活性；（4）ATP的調(diào)節(jié)作用；（5）磷酸鹽對次級代謝產(chǎn)物合成酶的調(diào)節(jié)；（6）磷酸鹽調(diào)控的分子機(jī)制——一般認(rèn)為作用在基因的轉(zhuǎn)錄水平上2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第二十七頁，共33頁。2.4.4碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)（一）碳源對次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)節(jié)碳分解產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用是指易被菌體迅速利用的碳源及其降解產(chǎn)物對其他代謝途徑酶的調(diào)節(jié)；（二）碳分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)的分子機(jī)制書中P31圖2-31吩噁嗪酮合成酶參與的放線菌素生物合成圖2-32吩噁嗪酮合成酶mRNA水平的Northern-blotting分析2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第二十八頁，共33頁。2.4.5氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)在抗生素的生物合成中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中存在多種氮源時，微生物總是先利用簡單的氮源，然后再分解利用復(fù)雜的氮源；并且當(dāng)這些簡單的氮源（如NH4+，氨基酸）濃度高時，幾乎不合成抗生素，只有在較低的濃度時，抗生素才開始合成。——銨離子阻遏作用或氮阻遏能夠被快速利用的氮源（如銨鹽、硝酸鹽、某些氨基酸）對許多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成有強(qiáng)烈的調(diào)節(jié)作用——氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)作用2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第二十九頁，共33頁。2.4.5氮分解產(chǎn)物調(diào)節(jié)（一）阻遏次級代謝產(chǎn)物生物合成酶的合成（二）調(diào)節(jié)初級代謝進(jìn)而影響次級代謝產(chǎn)物的合成2.4次級代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控第三十頁，共33頁。2.4.6菌體生長速率的調(diào)節(jié)菌體的生長速率是控制次級代謝的重要因素。次級代