生物技術(shù)概論基因工程

關(guān)于生物技術(shù)概論基因工程第1頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月基因片段的獲得、驗證和表達(dá)載體構(gòu)建為體外DNA重組，一般認(rèn)為是基因工程的上游技術(shù)；轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體篩選主要是進(jìn)行目的基因向目標(biāo)生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、體內(nèi)重組和重組體篩選鑒定，稱為基因工程的下游技術(shù)。

第2頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因片段獲得克隆載體(空)目的基因克隆載體基因克隆驗證切出片段插入片段測序驗證NY表達(dá)載體(空)目的基因表達(dá)載體表達(dá)載體驗證N表達(dá)載體構(gòu)建Y基因片段獲得第3頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月Y導(dǎo)入工程菌或病毒直接轉(zhuǎn)化介導(dǎo)生物驗證YN生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因DNA檢測目的基因RNA檢測目的Protein檢測Protein活性檢測室內(nèi)\田間功能驗證受體抗性篩選YNN篩選第4頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的基因的獲得

1、目的基因 基因工程中用來改造生物個體或用于生產(chǎn)某種產(chǎn)物的有用基因。

2、目的基因獲得方法

（1）化學(xué)合成法：按照預(yù)先設(shè)計的DNA序列，通過化學(xué)反應(yīng)合成目的基因片段的方法。合成方向：3-5

合成長度：10-500bp

優(yōu)點：目的性強(qiáng)，商業(yè)化程度高、自動化程度較高缺點：合成長度有限，設(shè)備昂貴第5頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法Step1：對在擔(dān)體上的第一個堿基進(jìn)行脫保護(hù)（DMTr基）反應(yīng)，用以準(zhǔn)備附加下一個新的堿基。Step2：活化新的堿基，準(zhǔn)備和前一個堿基進(jìn)行反應(yīng)。Step3：第二個堿基附加反應(yīng)到第一個堿基上。Step4：把第一個堿基沒有和第二個堿基反應(yīng)上的部分（反應(yīng)失敗部分）加帽封死（Capping反應(yīng))，不讓其進(jìn)行進(jìn)一步延伸反應(yīng)。Step5：對第二個堿基和第一個堿基的連接部分進(jìn)行氧化反應(yīng)，使3價磷變成5價磷，使合成產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。如需進(jìn)一步合成延伸堿基時，再回到Step1進(jìn)行合成。如此循環(huán)往復(fù)，可以不斷合成DNA堿基，直至合成完所需序列Step6：從CPG擔(dān)體上用氨水切離合成終了的OligoDNA。第6頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）

PCR法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計兩個引物，用PCR反應(yīng)獲得兩個引物之間該基因DNA序列的方法。引物來源：已知基因序列片段獲得：PCR

優(yōu)點：操作容易、目的性強(qiáng)缺點：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因，含內(nèi)含子

第8頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)RT-PCR法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計兩個引物，用PCR反應(yīng)獲得兩個引物之間該基因編碼序列(mRNA)的方法。

引物來源：已知基因序列片段獲得：RT-PCR

優(yōu)點：操作容易、目的性強(qiáng)缺點：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因第9頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（4）基因組文庫法：將基因組DNA切割成片段后，直接克隆構(gòu)建成基因組文庫，從基因組文庫中查找有用克隆的編碼序列的方法。

片段切割：識別序列為4堿基的限制性內(nèi)切酶克隆載體：病毒、噬菌體、酵母人工染色體優(yōu)點：能夠獲得未知基因，能夠?qū)蚪M所有基因進(jìn)行研究缺點:序列含內(nèi)含子,基因通用性較差第10頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

（5）cDNA文庫法：以生物體內(nèi)mRNA合成cDNA后直接克隆構(gòu)建成cDNA文庫，從中查找有用基因的方法。片段來源：mRNA逆轉(zhuǎn)錄克隆載體：質(zhì)粒載體優(yōu)點：便于獲得表達(dá)的基因的序列，獲得得序列為編碼序列無內(nèi)含子，費(fèi)用較低缺點：無法獲得未表達(dá)或表達(dá)水平較低基因

第12頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（六）T-DNA標(biāo)簽法（七）mRNA差異顯示法（八）反向克隆法第14頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月二、目的基因的克隆

在獲得了目的基因片段后，為了便于下一步操作，常需將該片段克隆到克隆載體上，進(jìn)行大量復(fù)制，并驗證該片段序列是否正確。

第15頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)克隆定義：1．克隆(名詞)：通過無性繁殖形成的與其親本一致的生物群體。2．克隆(動詞)：生物的無性繁殖。3.基因克隆：將目的基因片段連接到克隆載體上并進(jìn)行大量復(fù)制的過程。

第16頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)基因克隆步驟1、目的基因片段的獲得：PCR、酶切獲得2、目的基因片段的分離純化：電泳：分離回收：從膠內(nèi)提取、純化并定量。3、目的基因片段與克隆載體連接：平末端連接：平末端酶酶切獲得的或粘末端經(jīng)補(bǔ)平后的片段的連接。粘末端連接：粘末端酶酶切后獲得的片段的連接。

T/A克?。航?jīng)常規(guī)PCR反應(yīng)獲得的片段的連接。4、目的基因片段重組克隆載體篩選驗證5、目的基因片段復(fù)制第17頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)基因重組克隆篩選

將已經(jīng)連接外源基因的載體(DNA)向受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入，從大量的受體中篩選出成功導(dǎo)入目的基因克隆載體的個體，稱為重組克隆篩選。一般克隆載體的受體生物為大腸桿菌。常用的篩選方法有兩種：

1、抗生素抗性篩選

2、菌落藍(lán)、白斑篩選

第18頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC19第19頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月篩選結(jié)果模式圖第20頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)載體上插入基因片段的驗證1、DNA酶切法

第22頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、PCR法第23頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、DNA測序法

模板+dNTP+測序引物+測序Taq酶ddATPddTTPddGTPddCTP第24頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月三、目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建目的基因片段經(jīng)驗證正確后，需構(gòu)建適合于受體生物的基因表達(dá)載體。

表達(dá)載體的構(gòu)建過程就是把目的基因的閱讀框架(編碼序列)插入適宜的表達(dá)載體(空)的啟動子、終止子中間，形成表達(dá)框架。表達(dá)框架：啟動子-目的基因的ORF-終止子第25頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月1、表達(dá)載體的作用：使該基因能夠被導(dǎo)入新的生物體、進(jìn)行自主或整合復(fù)制并在生物體中啟動和表達(dá)。

一般情況下有三個串聯(lián)的表達(dá)框架：-1-2-3-1、啟動子-抗性基因的ORF-終止子

2、啟動子-目的基因的ORF-終止子

3、啟動子-報告基因的ORF-終止子第26頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月抗性基因：NptII：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，抗卡那霉素

Hyg:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因,抗潮霉素

gentR:慶大霉素抗性基因，抗慶大霉素

AmpR:氨芐青霉素抗性基因，抗青霉素類

TETR:四環(huán)素抗性基因,抗四環(huán)素報告基因：Gus:催化溴取代葡萄糖轉(zhuǎn)化無色-藍(lán)色反應(yīng)

Gfp:綠色熒光蛋白，合成綠色熒光蛋白

Lac（z）:催化溴取代半乳糖無色-藍(lán)色轉(zhuǎn)化反應(yīng)常用選擇標(biāo)記(編碼基因):第27頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、生物表達(dá)系統(tǒng)的特異性

不同生物中，啟動基因的表達(dá)需要不同的啟動子，在原核生物中，需要原核生物啟動子和終止子；在植物中，需要適合植物的啟動子和終止子。在原核生物中，經(jīng)常使用的啟動子有：T3、T7和SP6啟動子。在植物中，經(jīng)常使用的啟動子有：CaMV35S啟動子，胭脂堿合成酶基因終止子。

第28頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、植物表達(dá)載體系統(tǒng)目前常用的植物表達(dá)載體系統(tǒng)有：

1、質(zhì)粒載體系統(tǒng)：

2、病毒載體系統(tǒng)：第29頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月根癌農(nóng)桿菌及其質(zhì)粒第30頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒Vir:毒區(qū)，切割、轉(zhuǎn)運(yùn)、侵染區(qū)T-DNA區(qū)：被轉(zhuǎn)移整合到植物的DNA區(qū)域LB:左邊界RB：右邊界第31頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

把目的基因表達(dá)框架整合到改造后的Ti質(zhì)粒(卸甲質(zhì)粒)的T-DNA區(qū)域形成的質(zhì)粒載體。所有基因轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)元件位于同一質(zhì)粒上，稱為一元表達(dá)載體。但這類載體構(gòu)建困難，目的基因整合概率較低。改造Ti質(zhì)粒：取代致瘤和不必要的基因。

1）一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)）第32頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月Ti質(zhì)粒Vir:區(qū):環(huán)化成輔助質(zhì)粒T-DNA區(qū)：環(huán)化成微型Ti-質(zhì)粒第33頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

它由微型Ti質(zhì)粒（mini-Tiplasmid）和輔助Ti質(zhì)粒（helperTiplasmid）兩個獨立的質(zhì)粒構(gòu)成。輔助質(zhì)粒：提供Vir基因的轉(zhuǎn)移、切割、拼接功能微型Ti質(zhì)粒：含有T-DNA邊界、為一個廣譜質(zhì)粒，提供用于轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)框架。

2）雙元載體系統(tǒng)binaryvector第34頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)構(gòu)建過程

1．片段獲得：酶切法

2．表達(dá)載體線性化：酶切法

3、片段分離純化：電泳、條帶回收

4．連接：基因片段和載體DNA定向連接。

第36頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第37頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)表達(dá)載體驗證標(biāo)記基因篩選

酶切鑒定法

PCR鑒定法DNA雜交：斑點雜交、菌落原位雜交。(五)工程菌構(gòu)建

表達(dá)載體：直接轉(zhuǎn)化。工程菌構(gòu)建：生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入介導(dǎo)生物中。第38頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因轉(zhuǎn)移把外源DNA導(dǎo)入生物體，使生物體發(fā)生某種變化的過程稱為轉(zhuǎn)化(Transformation)。把一種生物的基因?qū)氲搅硗庖粋€生物體內(nèi)的過程稱為基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)。第四節(jié)基因工程下游技術(shù)第39頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）植物受體系統(tǒng) 受體:用于接收外源基因片段的生物個體、細(xì)胞或者組織。

1、植物組織：

2、原生質(zhì)體：

3、生殖細(xì)胞：

第40頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月1、植物組織： 受傷的細(xì)胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染。這些病毒或質(zhì)粒上的某些DNA通過各種不同的方式轉(zhuǎn)移到受傷的植物細(xì)胞，并形成愈傷組織。愈傷組織可以培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株。 該受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株，取材廣泛、適用性廣。但再生植株無性系變異較大，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差，嵌合體多。

第41頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、原生質(zhì)體：原生質(zhì)體是植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后的部分，是一個質(zhì)膜包圍的“裸露細(xì)胞”。原生質(zhì)體在合適的條件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。原生質(zhì)體比較容易完成一系列細(xì)胞操作或遺傳操作，而且還可以直接高效的捕獲外源基因。嵌合體少，遺傳穩(wěn)定性更差，培養(yǎng)周期長，難度大，再生頻率低。第42頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、生殖細(xì)胞：是以植物生殖細(xì)胞如：花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。目前主要以兩個途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化：一是利用花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞培養(yǎng)，從而建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化

第43頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點:

一旦將外源基因?qū)脒@些細(xì)胞，可以遺傳，利用植物自身的受粉過程，具有操作方法方便、簡單。缺點:

不足受到季節(jié)的限制；只能花期進(jìn)行，且無性繁殖的植物不能采用。

第44頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）直接轉(zhuǎn)化法 直接將純化的攜帶有外源基因的DNA導(dǎo)入生物體的方法。根據(jù)所采用的原理，可以分為：物理轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。

第45頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月1.物理轉(zhuǎn)化法：通過物理方法打開細(xì)胞屏障(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜)，將外源基因直接導(dǎo)入生物體的方法。

(1)電激法(電穿孔法)：

(2)超聲法(超聲穿孔法)：

(3)熱激法：

(4)顯微注射法：

(5)激光法(激光穿孔法)

(6)基因槍法(微彈法)

第46頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)電激法(電穿孔法)：細(xì)胞膜在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟拢?xì)胞膜被擊穿，細(xì)胞周圍的溶液中的外源DNA分子會通過這些孔洞進(jìn)入細(xì)胞中。移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動修復(fù)，外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后少數(shù)可能會整合到染色體上。

第47頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用這一原理，將原生質(zhì)體與外源基因混合置于電激儀的樣品小室中，然后在一定的電壓下進(jìn)行短時間直流電脈沖，電擊后的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)選擇標(biāo)記篩選帶有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子。

超聲穿孔法、熱激法、顯微注射法、激光法原理與此相同第48頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月物理轉(zhuǎn)化法步驟：1、目的基因表達(dá)載體DNA溶液配制2、受體細(xì)胞準(zhǔn)備(原生質(zhì)體制備)3、物理法導(dǎo)致細(xì)胞穿孔4、細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)和篩選第49頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月基因槍法(微彈法)第51頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法(1)聚乙二醇(PEG)法

PEG與多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等多聚物和二價陽離子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）及DNA常在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吸作用而被吸收。利用PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時要求原生質(zhì)體具有較高的活力。第53頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。

第54頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3.種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(1)花粉管通道法是我國科學(xué)家周光宇等首次提出外源DNA導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。其基本原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞第55頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)生殖細(xì)胞浸泡法生殖細(xì)胞(種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花藥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物等)直接浸泡在外源DNA溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w并整合和遺傳的方法。(3)胚囊、子房注射法使用顯微注射儀把外源基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生的壓力和卵細(xì)胞的吸收使外源DNA進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。第56頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）間接轉(zhuǎn)化法(生物轉(zhuǎn)化法)1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

有兩種農(nóng)桿菌:

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens） 發(fā)根農(nóng)桿菌(A.Rhizogenes)

被廣泛用于植物轉(zhuǎn)基因。原理：農(nóng)桿菌在適宜條件下(酸性,酚類誘導(dǎo)物如乙酰丁香酮)，將其質(zhì)粒T-DNA部分可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并插入到植物基因組中。第57頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2.病毒介導(dǎo)法

病毒通過膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成DNA并隨機(jī)整合到宿主基因組中?？山閷?dǎo)轉(zhuǎn)基因的病毒:(1)雙鏈DNA病毒

CaMV花椰菜花葉病毒

DaMV大麗花花葉病毒

CEKV石竹飾刻斑紋病毒

(2)單鏈DNA病毒

(3)單鏈RNA病毒

第58頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月癥狀第59頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法A、整體植株接種共感染法1、原理與方法：該途徑是模仿自然界農(nóng)桿菌天然的轉(zhuǎn)化過程，人為的在植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把攜帶目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷面上或植株體內(nèi)，使農(nóng)桿菌在植株內(nèi)進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，因此也稱為體內(nèi)轉(zhuǎn)化。2、受體材料：無菌苗、種子實生苗3、優(yōu)點：試驗周期短、具有較高的轉(zhuǎn)化效率、4、缺點：嵌合體多、篩選困難第60頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月B、葉盤轉(zhuǎn)化法

1、原理和方法：為了誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的侵染活性，把無菌苗葉片剪切成圓形或方形葉盤，人為地造成較大的傷口/面積比，葉盤浸蘸接種農(nóng)桿菌后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時間后，目的基因可經(jīng)農(nóng)桿菌整合到植物染色體上，經(jīng)轉(zhuǎn)接到脫菌培養(yǎng)基上除去農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后可得轉(zhuǎn)化植株。

2、受體材料：無菌苗葉片。

3、優(yōu)點：適用性廣、重復(fù)性好缺點：部分材料葉盤再生困難。

第61頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月C、原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法1、原理同上2、受體材料原生質(zhì)體3、優(yōu)點：易轉(zhuǎn)化、無嵌合體4、缺點：再生困難第62頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月常用植物基因轉(zhuǎn)化方法特點比較評價條件農(nóng)桿菌PEG法電擊法注射法基因槍法花粉管通道法受體材料組織、、原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體組織、細(xì)胞卵細(xì)胞寄主范圍有無無無無有性繁殖材料組培條件簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單不需要轉(zhuǎn)化率1-10%10-5-410-5-410-3-210-3-210%~10嵌合體比例有無無無多無操作復(fù)雜性簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單設(shè)備要求簡單簡單昂貴昂貴昂貴簡單工作效率高低低低高低單子葉植物少可行可行可行廣泛廣泛第63頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月大麥轉(zhuǎn)化示意圖第64頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月二、轉(zhuǎn)移植株篩選1、抗性篩選2、報告基因篩選3、DNA檢測4、RNA檢測5、蛋白質(zhì)檢測6、功能檢測第65頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第五節(jié)植物轉(zhuǎn)基因改良的應(yīng)用一、抗蟲改良1、常用抗蟲基因可分為三類:(1)細(xì)菌中分離的抗蟲基因,主要是蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白(Bt)基因;(2)植物中分離的抗蟲基因,主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因(Lec)等,應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI);(3)從昆蟲中分離的抗蟲基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。第66頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、殺蟲原理(1)BT基因

Bt基因又稱殺蟲結(jié)晶蛋白(insecticidalcrystalprotein.ICP)基因,來自于蘇云金芽孢桿菌,其殺蟲毒性來自芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白(或δ內(nèi)毒素)。原理:破壞昆蟲的消化系統(tǒng).這種蛋白通常以原毒素形式存在,當(dāng)昆蟲取食后,原毒素在消化道內(nèi)被活化，破壞腸道細(xì)胞膜上的特異性結(jié)合蛋白,使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道。

第67頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前常見的bt基因分為7類，共30多個小類，分別可以抗鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目害蟲以及線蟲，有些種類具有多種昆蟲抗性。

第68頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月抗蟲棉基因的轉(zhuǎn)化過程第69頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月70由中國農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對棉鈴蟲有顯著的抗性。與對照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。第70頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)胰蛋白酶抑制劑基因植物中存在三類蛋白酶抑制劑：

——絲氨酸蛋白酶抑制劑

——巰基蛋白酶抑制劑

——金屬蛋白酶抑制劑。其中絲氨酸蛋白酶抑制劑中的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)是目前研究得較為深入且應(yīng)用最為廣泛的基因。

第71頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白酶抑制劑殺蟲機(jī)理:

蛋白酶抑制劑與昆蟲消化道的蛋白酶相結(jié)合,形成酶-抑制劑復(fù)合物,使酶活性中心失活,從而阻斷或減弱酶的水解作用,干擾昆蟲對外來蛋白的正常消化,最終造成昆蟲非正常發(fā)育或死亡。

第72頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)植物凝集素基因(Lec)

植物凝集素是植物體普遍存在的一類保守性很強(qiáng)的非免疫性蛋白,能特異性識別并可逆地結(jié)合糖蛋白的糖基部分。

——麥胚凝集素(WGA),對歐洲玉米螟有良好的抗性?！┥徎?GNA)對蚜蟲、葉蟬、稻飛虱等同翅目吸食性害蟲有極強(qiáng)的毒性?！愣雇饽?p-Lec)能抑制豇豆象的生長。第73頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

作用機(jī)理:

當(dāng)昆蟲取食外凝集素后,外源凝集素在昆蟲消化道周圍的細(xì)胞膜糖蛋白專一性結(jié)合,從而影響所有營養(yǎng)的吸收,達(dá)到抗蟲目的。第74頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)淀粉酶抑制劑

淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲消化道內(nèi)α-淀粉酶活性,使食入的淀粉無法水解,阻斷了昆蟲主要能量來源；它與淀粉酶形成的酶-抑制劑復(fù)合物通過生理反饋調(diào)節(jié)作用,刺激昆蟲分泌過量的消化酶,產(chǎn)生厭食反應(yīng)。

第75頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(5)昆蟲毒素基因昆蟲神經(jīng)毒素控制著昆蟲許多關(guān)鍵的生理過程,影響昆蟲的生長、變態(tài)、生殖、代謝和行為等,近年來,人們已開始在基因工程中利用昆蟲神經(jīng)毒素防治害蟲。目前,蝎毒素和蜘蛛毒素兩種昆蟲特異性神經(jīng)毒素已被用于植物抗蟲基因工程。

第76頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

由于每一種抗蟲基因都有其局限性,近年來正在研究或已應(yīng)用于抗蟲基因工程的基因還有膽固醇氧化酶基因、營養(yǎng)殺蟲蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因、核糖體失活蛋白基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因等。

第77頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)抗真菌病改良1、抗真菌病基因根據(jù)植物的防衛(wèi)機(jī)制和病原菌致病機(jī)理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下兩個方面：一是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基因，二是生成抗菌物質(zhì)或激活抗菌物質(zhì)活性的基因第一類基因目前應(yīng)用較少，第二類基因已經(jīng)開始大量應(yīng)用。

第78頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、主要抗真菌病基因及作用機(jī)理(1)幾丁質(zhì)酶基因植物和微生物中幾丁質(zhì)酶基因編碼的降解幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，幾丁質(zhì)的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。(2)β-1，3-葡聚糖酶基因

β-1，3-葡聚糖是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。

第79頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)植物抗毒素基因植物產(chǎn)生的對病原真菌具有毒性的物質(zhì)，稱為植物抗毒素，編碼此類物質(zhì)合成酶的基因稱為植物抗毒素基因。目前已從不同科屬植物中鑒定了200多種，其中以類黃酮和萜烯類最多。其中的關(guān)鍵酶如苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)已經(jīng)克隆。其中芪合成酶基因已從葡萄、花生等植物中克隆并轉(zhuǎn)入煙草中獲得了抗病性植株。

第80頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(4)核糖體抑制蛋白基因(Ribosomeinhibitingprotein,RIP)

核糖體抑制蛋白是來源于植物能作用于其他遠(yuǎn)緣真核生物核糖體、抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白毒素?，F(xiàn)已經(jīng)從大麥中分離了RIP并在體外抑制了真菌的活性。(5)過氧化物酶基因參與苯丙烷代謝，形成木質(zhì)素、植保素及細(xì)胞壁酚類物質(zhì)。第81頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)抗細(xì)菌性病害改良1、抗菌肽基因抗菌肽是一類從動物、植物中分離得到的具有抗菌活性并且同源性較高的小分子多肽。抗菌肽由30多個氨基酸擦殘基組成，分子量大約為4kd，殺菌肽具有雙親性的α螺旋結(jié)構(gòu)，是殺菌肽破壞膜活性的關(guān)鍵。殺菌肽具有光譜抗菌性，主要分為A、B、D三種形式，其中A、B特別對革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大的殺傷力2、溶菌酶基因溶菌酶能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞外一些多糖之間的糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞缺乏支撐最后漲破。第82頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、病原菌本身抗性基因病原菌本身參與寄主識別的基因在寄主相互作用時其重要，將病原菌的這些基因轉(zhuǎn)入植物中，使其表達(dá)，從而干擾病原菌的正常生理代謝，導(dǎo)致植物表現(xiàn)出抗性。第83頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(四)抗病毒改良

1、CP基因病毒外殼蛋白(coatprotein,CP)基因是病毒編碼外殼蛋白的基因，利用病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)植物抗病毒能力的原理是：病毒的裸露的核酸進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被植物細(xì)胞中的CP包裹，阻止了翻譯和復(fù)制。

CP抑制病毒脫殼。侵染信號識別，如發(fā)現(xiàn)CP則不侵染，未發(fā)現(xiàn)則侵染。第84頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、病毒復(fù)制酶基因病毒復(fù)制酶基因在病毒侵入植物后與植物核糖體結(jié)合后轉(zhuǎn)錄并表達(dá)成病毒復(fù)制酶。該基因?qū)胫参锖螅烧T導(dǎo)植物產(chǎn)生病毒抗性。作用原理不明。病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外殼蛋白基因介導(dǎo)的的抗性，即使病毒接種量很高，仍然存在抗性。第85頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、病毒衛(wèi)星RNA

病毒中在核苷酸序列外有時會出現(xiàn)病毒衛(wèi)星RNA，他們不與核苷酸序列同源，但可以改變病毒的致病能力。優(yōu)點：靈敏，缺點：不確定性，增強(qiáng)或減弱致病性，來源有限，重組風(fēng)險、釋放風(fēng)險第86頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月4、核糖體抑制蛋白基因核糖體失活蛋白(ribosomeinactiveprotein,RIP)可以抑制病毒蛋白質(zhì)生物合成，使病毒不能合成自身蛋白質(zhì)。核糖體失活蛋白基因可以使植物獲得廣譜性病毒抗性。5、干擾素基因干擾素是脊椎動物在受病毒侵染后形成的一種小分子蛋白質(zhì)，能結(jié)合在細(xì)胞膜上形成抗病毒狀態(tài)。原理是干擾素可以抑制病毒與細(xì)胞膜的結(jié)合。第87頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月6、缺陷干擾顆粒缺陷干擾顆粒(defectiveinterfering,DI)是指那些序列與親本病毒相似但必須依賴親本病毒才能復(fù)制的RNA分子。它的序列與病毒同源?？共《驹恚焊偁幉《緩?fù)制酶。第88頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(五)抗除草劑改良1、各類除草劑的作用機(jī)理(作用的靶酶)(1)草甘膦(glyphosate)抑制芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶：莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶(EPSPS)活性。(2)磺酰脲(sulfonylurea)抑制支鏈氨基酸合成的關(guān)鍵酶：乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS)活性。(3)草丁膦(phosphinothricin)是有機(jī)磷除草劑，抑制植物谷胱甘肽合成酶(Glutaminesynthase，GS)(4)三嗪除草劑(triazine)抑制光合系統(tǒng)II的Qb蛋白與質(zhì)體醌的結(jié)合，阻斷光合作用。(5)溴苯腈(bromoxyril)抑制光合作用系統(tǒng)的電子傳遞鏈。第89頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗除草劑轉(zhuǎn)基因改良策略(1)靶蛋白過量產(chǎn)生：機(jī)理：產(chǎn)生過量靶蛋白，使抑制作用有限。舉例：采用超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)EPSPS，可以抗草甘磷類除草劑(2)靶蛋白基因突變：機(jī)理：尋找對除草劑不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白編碼基因。但往往導(dǎo)致植物減產(chǎn)。舉例：除草劑選擇法，尋找靶酶EPSPS/ALS/Qb的突變體，進(jìn)行繁殖，或者克隆其中的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。第90頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(3)除草劑降解和解毒基因利用：

——乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因-草丁膦，bar:來源于鏈霉素的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因——水解酶基因及其利用：腈水解酶(nitrilase)——超氧化物岐化酶：SOD第91頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(六)抗寒性改良1、抗凍蛋白基因(1)來源：生物中具有降低冰點和減少冰晶生長速度的蛋白質(zhì)。其中魚類研究較多。(2)抗凍機(jī)制：抗凍蛋白可以和冰核結(jié)合，減少冰晶生長，降低溶液冰點，從而抑制結(jié)冰傷害。2、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因第92頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月93轉(zhuǎn)基因甜椒轉(zhuǎn)基因辣椒可在冬季生長(以色列)

第93頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(七)抗旱、抗?jié)掣牧?、脯氨酸合成酶基因

(1)大豆(P5CR)、黑麥

(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)2、甜菜堿合成相關(guān)酶基因

(1)相關(guān)酶：膽堿加單氧酶(CMO)、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)第94頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、滲調(diào)蛋白基因(1)滲調(diào)蛋白(osmotin，OSM)，植物中普遍存在(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)4、胚胎后期豐富蛋白(lateralembryoaboundantprotein)基因(1)植物來源：禾本科植物(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)5、乙醇脫氫酶基因(1)植物中普遍存在：Adh-1,Adh-2(2)耐澇作用機(jī)理：缺氧ATP合成，解毒第95頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(八)耐貯性改良1、成熟激素相關(guān)基因改良:抑制乙烯產(chǎn)生作用(1)反義ACC合成酶(ACCsynthase)(2)反義ACC氧化酶(ACCoxidase,EthyleneformingEnzyme,EFE)(3)反義乙烯受體(Ethylenereciptor,ER)第96頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA技術(shù)AnantisenseoligobindsthesensemRNAand

preventssynthesisoftheproteincodedbythatmRNA第97頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月2、細(xì)胞壁降解相關(guān)基因改良：抑制細(xì)胞壁降解(1)反義多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）：(2)反義果膠裂解酶基因（PL）(3)反義果膠甲脂化酶基因（PE）(4)反義半乳糖苷酶基因(Gal)(5)反義木聚糖內(nèi)基轉(zhuǎn)移酶基因(XET)：(6)反義纖維素酶基因(cellulase)(7)反義聚木糖酶基因(XGase)第98頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月3、軟化相關(guān)胞內(nèi)物質(zhì)代謝基因(1)反義淀粉酶基因(amylase)(2)反義脂氧合酶基因(LOX)4、抗病性相關(guān)基因(1)PGIP第99頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(九)品質(zhì)改良1、營養(yǎng)成分改良(1)貯藏蛋白：小麥醇溶蛋白基因：增加新蛋白質(zhì)(2)脂肪改良：LOX基因：脂肪酸飽和度改變2、風(fēng)味改良(3)甜味蛋白：來源于甜玉米，改變風(fēng)味３、外觀品質(zhì)改良(4)著色度改良：色素基因工程：花色素第100頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月101轉(zhuǎn)基因西紅柿散發(fā)檸檬香味和玫瑰芳香的轉(zhuǎn)基因西紅柿第101頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月102無子的轉(zhuǎn)基因茄子(意大利)

第102頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月103第103頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(十)豐產(chǎn)性改良1、RuBP羧化酶Rubisco基因改良：提高二氧化碳的羧化效率，提高光合，進(jìn)而提高產(chǎn)量2、磷酸烯醇式丙酮酸異構(gòu)化酶PEPCase基因改良：提高二氧化碳羧化效率，進(jìn)而提高光合、產(chǎn)量3、磷酸蔗糖合成酶基因改良：促進(jìn)光合產(chǎn)物運(yùn)輸，減少反饋抑制4、ADPG焦磷酸酶基因改良：促進(jìn)運(yùn)輸，減少反饋抑制第104頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(十一)早實性改良１、lfy基因：縮短童期(植物不能開花結(jié)果的階段)(十二)農(nóng)藝性狀改良１、矮化性狀：矮化基因(dw)２、柱形性狀：柱形基因(co)３、短枝性狀：短枝基因(sp)４、生根能力：生根基因(rol)第105頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月第七節(jié)植物性狀分子標(biāo)記及應(yīng)用一、植物的性狀標(biāo)記二、植物性狀的分子標(biāo)記三、植物性狀分子標(biāo)記的方法四、植物性狀分子標(biāo)記的應(yīng)用

第106頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月一、植物的性狀標(biāo)記

植物的某些遺傳性狀和植物的某一外在形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)、生物大分子特征等存在對應(yīng)關(guān)系。 當(dāng)這個特征與這個遺傳性狀存在較嚴(yán)格的遺傳連鎖關(guān)系時，這個特征就是該性狀的遺傳標(biāo)記。第107頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月早熟晚熟綠葉紅葉紅葉是早熟性狀的標(biāo)記第108頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)記分類：1、形態(tài)標(biāo)記：如針葉，氣孔小抗旱性狀的標(biāo)記2、生理生化標(biāo)記：含水量、含糖量3、分子標(biāo)記：與性狀相關(guān)的生物大分子有無 同工酶標(biāo)記：與性狀相關(guān)的同工酶的有無

DNA標(biāo)記：有無某個特定的DNA片段或序列第109頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月二、植物的分子標(biāo)記

(一)概念

廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的與生物的表性性狀連鎖的可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括:

種子貯藏蛋白 同工酶:催化同一反應(yīng)的不同的酶分子.

狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記。

第110頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點

DNA分子標(biāo)記有其獨特的優(yōu)勢:1、直接檢測DNA分子,無表型效應(yīng),不受組織類別、發(fā)育階段、環(huán)境條件等的影響;2、多態(tài)性強(qiáng);3、源于基因組DNA自身的突變,因而數(shù)量極多;4、與不良性狀無必然的連鎖遺傳,不影響目標(biāo)性狀的表達(dá);

第111頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）植物分子標(biāo)記的種類

1、限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記

(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP),2、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記

(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD),3、DNA指紋標(biāo)記

DNAFingerprint,DNF4、簡單重復(fù)序列標(biāo)記

(simplesequencerepeat,SSR),5、序列特異性擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記

(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR),6、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記

(amplifiedfragmentlengthpolymorphicDNA,AFLP),.

第112頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月三、植物性狀分子標(biāo)記方法(一)酶切基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記

1、限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記，RFLPRFLP標(biāo)記獲得的原理是用DNA限制性內(nèi)切酶比較具有相對性狀的兩個群體在DNA序列上的不同。這個不同表現(xiàn)為酶切后形成DNA片段的大小不同。因此凡是可以引起酶切位點變異的突變?nèi)琰c突變、DNA的重組如插入和缺失等均可導(dǎo)致RFLP標(biāo)記的產(chǎn)生。

第113頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

此技術(shù)及其從中發(fā)展出來的一些變型均包括以下基本步驟：

1、DNA的提取

2、用限制性內(nèi)切酶酶切DNA3、用凝膠電泳分開DNA片段

4、查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段

5、在分離群體中驗證片段與性狀之間的遺傳距離。

第114頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月RFLPR.E.allelesagarosegelAaalleles第115頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記

1、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)

以隨機(jī)引物對兩個相對性狀的基因組DNA進(jìn)行PCR掃描，差別通過PCR產(chǎn)物條帶的不同(多態(tài)性)體現(xiàn)出來,該多態(tài)性條帶與目的性狀存在連鎖關(guān)系時,該條帶為該性狀的RAPD標(biāo)記。第116頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月RAPD第117頁，課件共134頁，創(chuàng)作于2023年2月

對于任一特定的引物，它在DNA兩條鏈上有特定的結(jié)合位點，如果這些特定的結(jié)合位點的分布符合PCR反應(yīng)