實(shí)驗(yàn)二十五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

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附件材實(shí)驗(yàn)二十大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)【目的掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 及轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)熟悉大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 及轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)原理【原理】大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 、轉(zhuǎn)化原細(xì)菌的生物學(xué)特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變叫轉(zhuǎn)化， 克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化）特指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。轉(zhuǎn)染（transfection）是指噬菌體、 DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過(guò)一定的方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入一個(gè)敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用氯化鈣溶液處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli.DH-5α細(xì)胞,使E.coli.DH-5α細(xì)胞的通透性增加，攝取外來(lái)DNA（本實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)粒DNA為pUC-18）能力增加，其原理為當(dāng)細(xì)菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNAase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并 轉(zhuǎn)化大腸桿菌的篩由于pUC-18（如圖）含有Ampr（氨芐青霉素抗性） 便具有在含Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，形成單個(gè)菌落，而未轉(zhuǎn)入pUC-18的E.coli.DH-5α細(xì)胞，不具有Ampr ，在含Amp的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)受到抑 和X-gal的LB平板上，由于pUC-18還帶有一段大腸桿菌β-半乳糖苷酶 （lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼α-片段的DNA序列，此結(jié)構(gòu)成為lacZ＇ ，在lacZ＇ 中的靠近5＇端有一段多克隆位點(diǎn)（MCS），而大腸桿菌含有β-半乳糖苷酶ω片段的編碼 活性，但兩者同時(shí)存在時(shí)能夠融為一體，形成具有酶活性的蛋白質(zhì)，這樣lacZ基因在缺少近 區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒圖23-1質(zhì)粒pUC18圖23-2質(zhì)粒pUC18酶切圖譜【器材高速溫控離心超凈工恒溫水10ml離心管、1.5m1EP培養(yǎng)皿（φ9cm燈推搖可調(diào)微量移液10ml試管、100ml三角瓶恒溫培0.45μm、0.22μm濾膜膜【試劑．E.coli.DH-5α．pUC-18質(zhì)粒（0.5μg/μlLB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g、細(xì)菌培養(yǎng)用酵母抽提物（bacto-yeastextract）5g、NaCl10g、加去離子水至800ml，攪拌，使溶質(zhì)完全溶解。用5mol/LNaOH（約0.2ml）調(diào)節(jié)pH值至7.4，加去離子水至總體積為1L，以1.034×105Pa高壓蒸氣滅菌20分鐘。．LB固體培上述LB液體培養(yǎng)基中按15g/L加入細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（bacto-agar），以1.034×105Pa高壓滅菌20分鐘。溶液尚未冷卻時(shí)，即應(yīng)取出培養(yǎng)基，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液．0.1mol/LCaCl2用蒸餾水溶解11g的CaCl2，定容至1000ml，1.034×105Pa，高壓滅菌20分鐘，-20℃保存．氨芐青霉素（Amp）溶取未開(kāi)封氨芐青霉素粉0.5g，加入滅菌蒸餾水5m1，配制成100mg/ml溶液，過(guò)濾除菌，-20℃分裝保存．IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷取1gIPTG溶于4ml去離子水中，再用水補(bǔ)至5ml，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，每份1ml分裝后，-20℃保存．X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml 液，不需濾過(guò)除菌，保存于1.5mlEP管中，用鋁箔包于-20℃避光保存．甘油取50ml甘油，121℃,30分鐘高溫滅菌?！静僮鳎惺軕B(tài)細(xì)胞滅菌操作步驟于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，下同（1）用無(wú)菌小槍尖從E.coli.DH-5αLB平板上挑單菌落，將此槍尖放于含5m1LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，200r/min振蕩過(guò)夜，第二天將此試管中的5m1LB培養(yǎng)基接種于含100m1LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，300r/min振蕩培養(yǎng)2～4h，到A600一般在0.2~0.4之間（約含5×107個(gè)細(xì)/ml），為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前（2）將培養(yǎng)物于冰上放置10分鐘，然后轉(zhuǎn)移入兩個(gè)50ml離心管中，4℃，4000r/min離心10分鐘，棄去上清，倒置離心管1分鐘，流盡剩余液體，加入10m1預(yù)冷的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)菌，置冰浴中10分鐘；（3）于4℃，4000rpm離心10分鐘回收細(xì)胞，輕輕倒去上清，每50ml的原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷CaCl2溶液，按200μl一管分裝于1.5m1EP管中,若不馬上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為10%的滅菌甘油，置于-70℃凍存。．大腸桿菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（熱休克法（1）取一支感受態(tài)大腸桿菌加入50μl含20ngpUC-18的TE緩沖液，溫和混勻，置冰上30分鐘，此步驟操作時(shí)應(yīng)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組①取50μl含20ngpUC-18的TE緩沖液加入感受態(tài)細(xì)胞，做陽(yáng)性對(duì)照（A組②不加任何DNA的感受態(tài)細(xì)胞 對(duì)照（B組），僅加入50μlTE緩沖液（2）轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置90秒，迅速放回冰中（3）將細(xì)胞冷卻1-2分鐘后，立即加入0.8m1LB液體培養(yǎng)基，混勻，37℃保溫45分鐘．轉(zhuǎn)化大腸桿菌的篩（1）Amp然后各取50μlA組、B組中的培養(yǎng)物分別用推子涂布于兩塊含Amp(100μg/ml)的LB平板中。另作一對(duì)照組，另各取50μlA組、B組中的培養(yǎng)物用推子涂布于兩塊不含Amp的LB平板中。將上述平皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜；第二天觀察各平皿上細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并作記錄。（2）β-半乳糖苷酶系統(tǒng)在預(yù)制好的LB瓊脂平板（含Amp100μg/ml）上，加上40μl20mg/ml的X-gal和4μl200mg/ml的IPTG溶液；用滅菌推子，將X-gal和IPTG溶液均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37℃放置3小時(shí)，待溶液全部吸入瓊脂表面，將取A組50μl細(xì)菌涂布于平板中，將平皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜,第【注意事項(xiàng)．在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意無(wú)菌（實(shí)驗(yàn)菌除外）操作【思考題 ．藥物篩選法和藍(lán)白斑篩選法（α-互補(bǔ)）的原理各是什么．氯化鈣法和氯化鎂 感受態(tài)細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)各是什么附：氯化【試劑1×TSS致敏緩沖10%PEG（MW=40005%DMSO（0.45μm過(guò)濾50mmol/LMgCl用LB培養(yǎng) ，調(diào)pH值至【操作感受態(tài)細(xì)胞 及長(zhǎng)期凍（一）E.coli.DH-5α菌株于LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期，然后轉(zhuǎn)移入兩個(gè)50ml離心管中，4000rpm離心10分鐘，棄去上清（二）用5ml的1×TSS致敏緩沖液（冰預(yù)冷）懸浮細(xì)胞，然后分裝成0.1ml一份速置冰上溫和混勻， 。使用前，從-70℃取 的感受態(tài)細(xì)菌