色譜法基本概念

關(guān)于色譜法基本概念1第1頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-1色譜法概述

5-1-1色譜法的特點(diǎn)、分類(lèi)和作用

5-1-2色譜分離過(guò)程

5-1-3色譜流出曲線與術(shù)語(yǔ)5-2色譜理論基礎(chǔ)

5-2-1塔板理論

5-2-2速率理論

5-2-3分離度5-3定性定量方法

5-3-1色譜定性分析

5-3-2色譜定量分析目錄第2頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-1色譜法概述

5-1-1色譜法的特點(diǎn)、分類(lèi)和作用

1.概述

混合物最有效的分離、分析方法。俄國(guó)植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置：色譜原型裝置，如圖。色譜法是一種分離技術(shù)，試樣混合物的分離過(guò)程也就是試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配過(guò)程。其中的一相固定不動(dòng)，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過(guò)此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動(dòng)相。第3頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。（多次萃?。?/p>

與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè)。

兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)第4頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.色譜法分類(lèi)

(1)氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣）。

按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜(2)液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液）。

按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。離子色譜：液相色譜的一種，以特制的離子交換樹(shù)脂為固定相，不同pH值的水溶液為流動(dòng)相。第5頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(3)其他色譜方法薄層色譜和紙色譜：比較簡(jiǎn)單的色譜方法凝膠色譜法：測(cè)聚合物分子量分布。超臨界色譜:

CO2流動(dòng)相。高效毛細(xì)管電泳:

九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。第6頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高

復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高

可以檢測(cè)出μg.g-1(10-6)級(jí)甚至ng.g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3）分析速度快

一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣

氣相色譜：沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：

被分離組分的定性較為困難。第7頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-1-2色譜分離過(guò)程

色譜分離過(guò)程是在色譜柱內(nèi)完成的。填充柱色譜:氣固(液固)色譜和氣液(液液)色譜，兩者的分離機(jī)理不同。氣固(液固)色譜的固定相:

多孔性的固體吸附劑顆粒。固體吸附劑對(duì)試樣中各組分的吸附能力的不同。氣液(液液)色譜的固定相:

由擔(dān)體和固定液所組成。固定液對(duì)試樣中各組分的溶解能力的不同。氣固色譜的分離機(jī)理:

吸附與脫附的不斷重復(fù)過(guò)程；氣液色譜的分離機(jī)理：氣液(液液)兩相間的反復(fù)多次分配過(guò)程。第8頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第9頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.氣相色譜分離過(guò)程

當(dāng)試樣由載氣攜帶進(jìn)入色譜柱與固定相接觸時(shí)，被固定相溶解或吸附;

隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;

揮發(fā)或脫附下的組分隨著載氣向前移動(dòng)時(shí)又再次被固定相溶解或吸附;

隨著載氣的流動(dòng)，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附的過(guò)程反復(fù)地進(jìn)行。第10頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.分配系數(shù)（partionfactor）K

組分在固定相和流動(dòng)相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過(guò)程叫做分配過(guò)程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的濃度（單位：g/mL）比，稱為分配系數(shù)，用K表示，即：分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。第11頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一定溫度下，組分的分配系數(shù)K越大，出峰越慢；試樣一定時(shí)，K主要取決于固定相性質(zhì)；每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同；選擇適宜的固定相可改善分離效果；試樣中的各組分具有不同的K值是分離的基礎(chǔ)；某組分的K=0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。第12頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.分配比（partionradio）k

在實(shí)際工作中，也常用分配比來(lái)表征色譜分配平衡過(guò)程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比：

1.分配系數(shù)與分配比都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，隨分離柱溫度、柱壓的改變而變化。

2.分配系數(shù)與分配比都是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的參數(shù)，數(shù)值越大，該組分的保留時(shí)間越長(zhǎng)。

3.分配比可以由實(shí)驗(yàn)測(cè)得。分配比也稱：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；第13頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系

式中為相比。填充柱相比：6～35；毛細(xì)管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

VM為流動(dòng)相體積，即柱內(nèi)固定相顆粒間的空隙體積；VS為固定相體積，對(duì)不同類(lèi)型色譜柱，VS的含義不同；氣-液色譜柱：VS為固定液體積；氣-固色譜柱：VS為吸附劑表面容量；第14頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.分配比與保留時(shí)間的關(guān)系

滯留因子（retardationfactor）：us：組分在分離柱內(nèi)的線速度；u：流動(dòng)相在分離柱內(nèi)的線速度；滯留因子RS也可以用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω表示：

若組分和流動(dòng)相通過(guò)長(zhǎng)度為L(zhǎng)的分離柱，需要的時(shí)間分別為tR和tM，則：由以上各式，可得：tR=tM(1+k)第15頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-1-3色譜流出曲線與術(shù)語(yǔ)1.基線

無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。

2.保留值（1）時(shí)間表示的保留值

保留時(shí)間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；

死時(shí)間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時(shí)間；

調(diào)整保留時(shí)間（tR＇）：tR＇=tR－tM

第16頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（2）用體積表示的保留值

保留體積（VR）：

VR=tR×F0F0為柱出口處的載氣流量，單位：mL/min。

死體積（VM）：

VM=tM×F0

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

第17頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.相對(duì)保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：

r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1

相對(duì)保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無(wú)關(guān)，它表示了固定相對(duì)這兩種組分的選擇性。第18頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.區(qū)域?qū)挾?/p>

用來(lái)衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（1）標(biāo)準(zhǔn)偏差()：即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半。（2）半峰寬(Y1/2)：色譜峰高一半處的寬度Y1/2=2.354（3）峰底寬(Wb)：Wb=4第19頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.色譜流出曲線的數(shù)學(xué)描述

色譜峰為正態(tài)分布時(shí)，色譜流出曲線上的濃度與時(shí)間的關(guān)系為：

當(dāng)色譜峰為非正態(tài)分布時(shí)，可按正態(tài)分布函數(shù)加指數(shù)衰減函數(shù)構(gòu)建關(guān)系式。第20頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

色譜理論需要解決的問(wèn)題：色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。組分保留時(shí)間為何不同？色譜峰為何變寬？組分保留時(shí)間：色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制；（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）色譜峰變寬：色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制；（兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力，擴(kuò)散）兩種色譜理論：塔板理論和速率理論；5-2色譜理論基礎(chǔ)第21頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

塔板理論的假設(shè)：

(1)在每一個(gè)平衡過(guò)程間隔內(nèi)，平衡可以迅速達(dá)到；

(2)將載氣看作成脈動(dòng)（間歇）過(guò)程；

(3)試樣沿色譜柱方向的擴(kuò)散可忽略；

(4)每次分配的分配系數(shù)相同。5-2-1塔板理論-柱分離效能指標(biāo)1.塔板理論（platetheory）半經(jīng)驗(yàn)理論；將色譜分離過(guò)程比擬作蒸餾過(guò)程，將連續(xù)的色譜分離過(guò)程分割成多次的平衡過(guò)程的重復(fù)（類(lèi)似于蒸餾塔塔板上的平衡過(guò)程）；第22頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

色譜柱長(zhǎng)：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：保留時(shí)間包含死時(shí)間，在死時(shí)間內(nèi)不參與分配!第23頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。用不同物質(zhì)計(jì)算可得到不同的理論塔板數(shù)。組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：第24頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.塔板理論的特點(diǎn)和不足(1)當(dāng)色譜柱長(zhǎng)度一定時(shí)，塔板數(shù)n

越大(塔板高度H越小)，被測(cè)組分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效能則越高，所得色譜峰越窄。

(2)不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)。(3)柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí)，無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無(wú)法分離。(4)塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的載氣流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。第25頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-2-2速率理論-影響柱效的因素1.速率方程

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，

u：載氣的線速度(cm/s)

減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？第26頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子

固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。第27頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng)

B=2νDgν

：彎曲因子，填充柱色譜，ν<1。

Dg：試樣組分分子在氣相中的擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1）

(1)存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;(2)擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;(3)分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān)，流速↓，滯留時(shí)間↑，擴(kuò)散↑;(4)擴(kuò)散系數(shù)：Dg

∝(M載氣)-1/2；M載氣↑，B值↓。第28頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

k為容量因子；Dg

、DL為擴(kuò)散系數(shù)。df:有效液膜的厚度。

減小擔(dān)體粒度，選擇小分子量的氣體作載氣，可降低傳質(zhì)阻力。C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng)

傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL即：

C=（Cg+CL）第29頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.載氣流速與柱效——最佳流速載氣流速高時(shí)：

傳質(zhì)阻力項(xiàng)是影響柱效的主要因素，流速，柱效。載氣流速低時(shí)：

分子擴(kuò)散項(xiàng)成為影響柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲線與最佳流速：

由于流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用，流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)載氣流速u(mài)作圖，曲線最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。第30頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.速率理論的要點(diǎn)(1)組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展柱效下降的主要原因。(2)通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。(3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響。(4)各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小，使柱效提高，但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響，選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。第31頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-2-3分離度

塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對(duì)的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組份能夠被完全分離。難分離物質(zhì)對(duì)的分離度大小受色譜過(guò)程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素。色譜分離中的四種情況如圖所示：①柱效較高，△K(分配系數(shù))較大,完全分離；②△K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；③柱效較低，△K較大,但分離的不好；④△K小，柱效低，分離效果更差。第32頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分離度的表達(dá)式：R=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的標(biāo)準(zhǔn)）。第33頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相鄰兩峰的峰底寬近似相等），引入相對(duì)保留值和塔板數(shù)，可導(dǎo)出下式：第34頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）分離度與柱效

分離度與柱效的平方根成正比，r21一定時(shí)，增加柱效，可提高分離度，但組分保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長(zhǎng)。（2）分離度與r21

增大r21是提高分離度的最有效方法，計(jì)算可知，在相同分離度下，當(dāng)r21增加一倍，需要的n有效減小10000倍。

增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。第35頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例題1：

在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長(zhǎng)是多少？解：r21=100/85=1.18

n有效=16R2[r21/(r21—1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱長(zhǎng)為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。第36頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例題2：

在一定條件下，兩個(gè)組分的保留時(shí)間分別為12.2s和12.8s，計(jì)算分離度。要達(dá)到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長(zhǎng)。解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？第37頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-3定性定量方法

5-3-1色譜定性分析1.利用純物質(zhì)定性的方法

利用保留值定性：通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。

利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。2.利用文獻(xiàn)保留值定性（利用相對(duì)保留值r21定性）

相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來(lái)進(jìn)行定性鑒定。第38頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

又稱Kovats指數(shù)(Ⅰ)，是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。測(cè)定方法：將正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定其保留指數(shù)為分子中碳原子個(gè)數(shù)乘以100（如正己烷的保留指數(shù)為600）。其它物質(zhì)的保留指數(shù)（IX）是通過(guò)選定兩個(gè)相鄰的正構(gòu)烷烴，其分別具有Z和Z＋1個(gè)碳原子。被測(cè)物質(zhì)X的調(diào)整保留時(shí)間應(yīng)在相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留值之間如圖所示：3.保留指數(shù)第39頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法

小型化的臺(tái)式色質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS；LC-MS）色譜-紅外光譜儀聯(lián)用儀；組分的結(jié)構(gòu)鑒定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD第40頁(yè)，課件共46頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5-3-2色譜定量分析1.峰面積的測(cè)量

（1）峰高（h）乘半峰寬（Y1/2）法：近似將色譜峰當(dāng)作等腰三角形。此法算出的面積是實(shí)際峰面積的0.94倍：

A=1.064h·Y1/2

（2）峰高乘平均峰寬法：當(dāng)峰形不對(duì)稱時(shí)，可在峰高0.15和0.85處分別測(cè)定峰寬，由下式計(jì)算峰面積：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85

）/2

（3）峰高乘保留時(shí)間法：在一定操作條件下，同系物的半峰寬與保留時(shí)間