核酸的提取分離

生化工藝學(xué)課件

第五章核酸的提取分離第五章核酸的提取分離§5.1概述§5.2核酸的理化性質(zhì)§5.3核酸的作用與用途§5.4動(dòng)物臟器核酸的提取分離方法§5.5轉(zhuǎn)移因子的制備§5.6輔酶A的提取§5.7復(fù)合輔酶的提取§5.8從啤酒酵母中提取RNA§5.1概述核酸（nucleicacid)核苷酸(nucleotide)

磷酸(phosphoricacid)核苷(nucleoside)

戊糖(pentose)堿基(base)組成核苷酸的堿基Fig.2-4TheprimarystructureofDNA.脫氧核糖核酸（DNA）主要存在于細(xì)胞核的染色體中，核糖核酸（RNA）主要存在于細(xì)胞的微粒體中，各種生物體含有核酸的多少不同應(yīng)用于臨床的核酸及其衍生物類生化產(chǎn)品越來越多我國人工合成丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸，76個(gè)核苷酸，與天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，有接受丙氨酸、將攜帶的丙氨酸摻入到蛋白質(zhì)中的生物活力呈味核苷酸是目前國際上流行的新型鮮味劑，其學(xué)名為5－IMP（肌苷酸鈉）、5－GMP（鳥苷酸鈉）、I＋G（50％IMP＋50GMP），我國第三代鮮味劑雞精的特點(diǎn)為：由雞肉、雞蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及多種調(diào)味料復(fù)合而成。核酸類的藥物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶類相關(guān)的衍生物保健品：某核酸公司宣稱其產(chǎn)品具有增強(qiáng)基因自主修復(fù)能力，還能改善微循環(huán)、改善腦機(jī)能；促進(jìn)新陳代謝、抗疲勞；提高免疫力；活化皮膚細(xì)胞、潤膚美容。

核酸在食品和藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用？核酸工業(yè)的市場分析核酸藥物產(chǎn)品的開發(fā)已有近70年歷史。目前，日本是核酸產(chǎn)品的最大生產(chǎn)國，其年產(chǎn)量約7500噸，約占世界產(chǎn)量的90%；西方國家中，意大利也有核酸產(chǎn)品，但產(chǎn)量不是很大。近年來，韓國核酸產(chǎn)業(yè)興起，主要為調(diào)味品。我國核酸產(chǎn)品的研究開發(fā)起步較早，并取得了令人矚目的成就。然而目前我國核酸藥物產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，僅ATP一項(xiàng)每年就從日本進(jìn)口金額達(dá)八千萬美元§5.2核酸的理化性質(zhì)§5.2.1核酸的一般性質(zhì)1、DNA分子與蛋白質(zhì)分子、RNA相對分子質(zhì)量？2、DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末，均微溶于水，稀堿溶液中成鹽后易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，但可溶于乙醇的水溶液，乙醇＞50％（w/w）時(shí)，DNA析出，當(dāng)＞75％時(shí)，RNA也沉淀出來→溶解度差別分離≥106幾千到百萬幾萬到幾百萬鹽溶液中溶解度差異提取RNA時(shí)NaCl鹽溶液濃度僅為0.14mol/L即可而提取DNA時(shí)，需先用0.14mol/LNaCl將RNA除掉，再繼續(xù)增加NaCl濃度至1mol/L時(shí)才能夠?qū)NA提取出來§5.2.1核酸的一般性質(zhì)3、DNA極稀的溶液黏度極大，變性時(shí)黏度降低，pH超出5.6-10.9時(shí)，相對黏度突然降低4、可被酸、堿或酶水解成各種組分，用層析、電泳等方法分離，主要利用：

RNA的磷酸酯鍵對堿敏感：室溫，0.3~1mol/LKOH，24h，可將RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。★DNA抗堿水解★生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解?！?.2.2核酸的紫外吸收性質(zhì)嘌呤、嘧啶環(huán)→共軛雙鍵→紫外吸收，核酸λmax260nm附近，而λmin230nm1、鑒定純度純DNA的A260/A280≥1.8；純RNA的A260/A280≥2.0若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280↓2、含量計(jì)算，吸光值為1.00時(shí)，相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用OD260nm測定其濃度另一方面DNA和RNA含磷含糖，所以可通過糖含量及磷含量的測定方法間接表征核酸的含量RNA所含糖為核糖→苔黑酚法測定；DNA所含糖為脫氧核糖→二苯胺法測定。含磷量測定時(shí)均需先經(jīng)過消化將有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷才能測定，純RNA含磷量為9％，而純DNA含磷量為9.2%?！?.2.3核酸的變性和復(fù)性

高溫（熱變性）、酸堿（pH小于4或大于11）及某些變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）能破壞核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。變性后的理化性質(zhì)★DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。粘度降低，浮力密度升高。二級結(jié)構(gòu)改變，部分失活。260nm吸收值升高?！?/p>

增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)：在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。熔解歸溫度渠（Tm）：★D飲NA的雙初螺旋芹結(jié)構(gòu)猴失去怒一半缸時(shí)對因應(yīng)的矛溫度宋。濃度50披ug它/m破L時(shí)，避雙鏈DN皺A律A26妹0=1挨.0板0；完全紛變性版（單孩鏈）A26裳0=肉1.段37當(dāng)A26詳0增加鄭到最草大增業(yè)大值奧一半茶時(shí)，豎即1.素18那5時(shí)，公對應(yīng)射的溫犬度即床為Tm。DN母A的Tm一般睛在82獻(xiàn)—9簽5℃之間影響DN妻A的Tm值的供因素1、DN前A均一聯(lián)性熔：均一墻性高牧，變菌性的畏溫度澤范圍名越窄我，據(jù)是此可片分析DN怪A的均哨一性行。2、G-財(cái)C含量與Tm值成肚正比繁（wh杜y？）：汗測定Tm，可仆推知G-鏈C含量潤。G-蝕C%仆=（Tm-6莊9.含3）×2滲.4懸43、介猶質(zhì)中腦離子凡強(qiáng)度薯：離子任強(qiáng)度恨高，Tm高，院范圍史變寬雖。G-桃C對中姓含有3個(gè)氫暑鍵，吊較A-占T對中削僅有2個(gè)氫問鍵更流為穩(wěn)脖定§5虎.2徐.4核酸格的測懸定1、紫費(fèi)外分我光光殊度法2、定象糖法妙：DN立A、RN即A經(jīng)酸批水解覺后，悲嘌呤噸易脫愚下形駁成無史嘌呤毒的醛謊基化券合物改，或膨水解條得到核糖箱和脫佩氧核恒糖→能與果某些掩酚類毀、苯后胺類餓化合讀物結(jié)刃合成異有色梳物質(zhì)芳（簡怠便，炸定性or顏色汽深淺片定量涂）RN尺A＋濃獎(jiǎng)鹽酸墾＋苔駱黑酚煌（3，5-二羥誓甲苯更）共戀熱→則綠色DN寄A＋濃泥醋酸罩＋少終量濃暢硫酸透＋二黑苯胺御共熱角→藍(lán)峽色3、定翼磷法天：DN箱A含磷插量9.吊2%，RN腐A含磷泉量9％1g磷相煤當(dāng)于11贊g核酸豆，消臭化后嫩用鉬財(cái)酸胺晝定磷濫試劑僅測構(gòu)得與刊嘌呤盤連接評的糖4、核己酸分神析時(shí)書樣品梁的預(yù)稻處理用定輪磷、淹定糖云或紫透外吸臣收的紐奉方法噸測定保某一如生物照材料趙中核賄酸或怒其水況解物茶含量公時(shí)，亦需先極經(jīng)預(yù)浸處理限→去我掉雜丈質(zhì)，款避免紀(jì)干擾1）將生匠物組擁織細(xì)紛胞在計(jì)低溫足下磨尾碎成抖勻漿唯→稀欲三氯稻乙酸or退1％高初氯酸浮低溫墓抽提昆幾次列，得查到沉淀顏為蛋把白質(zhì)拘、核場酸、然脂類濕、多硬糖等2）用有戰(zhàn)機(jī)溶街劑抽丙提去除彩脂溶綠性磷龍脂等物霧質(zhì)→晴不溶咽于酸的撫非脂估化合鍛物如DN擠A、RN蕉A、蛋炮白質(zhì)鞠、磷按蛋白鳳和少姻量磷答化合納物再采雀用酸（5％三冬氯乙漸酸或6％高收氯酸壤，90oC，15驅(qū)mi記n，再富定糖仁法測葛定）臨或堿處交理法（37oC，0.辨3-斜1m膜ol庸/LNa拋OH，18弓h(huán)，DN搞A，RN急A能夠搖分開計(jì)）§5濕.3核酸疫的作帖用與然用途核酸憲作用虛：與生慨物的郊生長宴、發(fā)杜育、慎繁殖鉆、遺腥傳和飼變異勢有密豬切關(guān)嚇系，竿又是勞蛋白砌質(zhì)合捷成不霞可缺扇少的賠物質(zhì)佩→諸襖多惡允性腫蛾瘤、瘦遺傳雨性疾努病及功放射懂病均栽與核體酸改芝變有牽關(guān)1、嘌互呤和欠嘧啶蛾類生條化產(chǎn)宿品：核酸漫組成且中的埋堿基丙嘌呤冊化合文物和澇嘧啶俯化合湊物都吧有良律好的頌抗腫簡瘤作剝用，亞阻斷膛蛋白打質(zhì)、凝核酸映的生貌物合怕成，政抑制酒癌細(xì)兄胞的障增殖浴，如言：5-氟尿占嘧啶2、核睛苷類失生化料產(chǎn)品專：如輔樣酶A3、核載苷酸基類生吃化產(chǎn)毒品：如免販疫核鉛糖核箱酸iR尤NA、轉(zhuǎn)羅移因捧子§5沙.4動(dòng)物例臟器加核酸際的提淡取分郊離方障法核酸爹及其谷衍生促物類耕藥物神，屬天征然大撥分子倡，結(jié)某構(gòu)復(fù)免雜→場采用勞生物密材料衫為原吵料的提取虹法制造核苷急酸類電及其規(guī)衍生輩物，小分沫子，損結(jié)構(gòu)早簡單→化汽學(xué)合潑成法一、RN瘋A的提種取分囑離動(dòng)物獅組織肯搗碎重→勻初漿→0.衰14機(jī)mo牙l/定L撇Na核Cl溶液院提取姜→調(diào)pH至4.扯5，RN罷A.蛋白呼↓，RN喉A與蛋猜白質(zhì)谷分開奮的方蝴法：1）乙竿醇沉摟淀法2）鹽前酸胍撿和去蓬污劑傅分離坊法3）酚小法二、DN公A的提伯取分州離利用手核糖犁核蛋頂白在0.印14衛(wèi)mo壘l/協(xié)LNa音Cl可溶，而DN砌A核蛋塵白則嬌可溶怕于水矛或高絮濃度癥的鹽股溶液濱（1m喇ol漆/LNa士Cl）組織惰搗碎薯→0.訪14駕mo字l/墻LNa閱Cl反復(fù)柄洗滌吸以去巨除RN鞠A（或0.擔(dān)1m乞ol翼/LNa蹲Cl＋0.道05顯mo掀l/雜LNa傳Cl枸櫞狂酸鈉朽）→仙去污樂劑SD罷S使蛋游白質(zhì)掠變性旅→沉淀貝用1m魄ol窄/LNa名Cl溶解→乙態(tài)醇沉午淀→膛去污溝劑精吉制，海反復(fù)揚(yáng)多次常用件去蛋興白方煙法：葛含有扮新醇賄或異菌戊醇現(xiàn)的氯地仿沉?xí)竦砗四岬鞍滋摇x航心；SD幕S；苯辟酚處殃理，姨離心兔分層提取慕核酸訪時(shí)要懷注意炎保持笨其完旨整性綠（防絹過酸川、堿猛、低嗚溫）§5氧.5轉(zhuǎn)移論因子啟的制雁備Tr咐an館sf慨er酒f宵ac脆to謹(jǐn)r（TF）一種須多核扯苷酸勻和多亂肽小姿分子遍物質(zhì)汽，為每細(xì)胞好免疫棗促進(jìn)聞劑?？缚蓪⒃９w扯的細(xì)韻胞免麻疫性以轉(zhuǎn)移貢給受得體正土常的貝淋巴澤細(xì)胞圖，并賺能促渣進(jìn)釋亭放干童擾素慕。融臨床碎用于足免疫希缺陷財(cái)?shù)牟☆惾?，估如感崇染、溝皰疹劃、乙按肝、駝麻疹鑰等。約對惡淡性腫廳瘤可飼作為爽輔助改治療根劑；令作用蘋無種窄屬特碧異性。制備TF的原泡料除特面異性訪供體體白細(xì)世胞外防，一庸般采國用正捕常人駐血液流、脾益和扁振桃體應(yīng)等原沒料提取新工藝劇中主要腦采用箱透析否、柱慈層析駝、超扛濾及揭加絮拆凝劑件和助鍛濾劑佩再過提濾等§5缺.6輔酶A的提歐取輔酶A（Co陵en簡zy性me待A，Co隨A），是孟由等福分子資的泛狀酸、絡(luò)腺嘌荒呤、坑核糖應(yīng)、氨滲基乙風(fēng)硫醇票和三聯(lián)分子著磷酸圈構(gòu)成粉，AD陶P的衍奔生物躍或類懸似物裕，相野對分碑子量抽為76裁7.鍵54主要肉起傳擔(dān)遞酰研基的收作用，來墊回接誘受和炒放出陵?；?，攜伐帶酰熱基的忘部位勵(lì)在－SH上→匙以HS僚Co沉A表示對糖葵、脂葵類和撓蛋白吸質(zhì)的圍代謝零具有薄非常岡重要繩的影挨響，作為姜白細(xì)撓胞減想少癥店、原序發(fā)性紗血小非板減牢少性落紫癜反、功線能性問低熱預(yù)、脂細(xì)肪肝劉、各抵種肝蘆炎、叨冠狀比動(dòng)脈富硬化眉、心霞急梗依塞等痕疾病述的重對要輔堪助藥錫物§5賞.6輔酶A的提件取分離碌過程探：預(yù)處備理→排提取爭→除拖蛋白倍→CM鳴A樹脂熟純化攀→LD啟-6秀01大孔卸吸附百劑二艙次純宣化→索濃縮蒙、沉當(dāng)?shù)?、披干燥工藝袋過程合中Co何A的定逼性跟民蹤方蓬法：硝基臨鹽巰謀基顯渠色法魚（Co獅A分子裁上的嘴巰基廢能與儉亞硝繁基鐵發(fā)氰化譜物產(chǎn)橋生不簡穩(wěn)定客的強(qiáng)節(jié)烈紅驗(yàn)色）定量削檢測故方法復(fù)：磺胺狐乙酰且化法激和磷案酸轉(zhuǎn)眠乙酰尋化酶祝（PT湯A）紫城外分臥光光皆度法一般液工藝必制得畢的Co喊A制劑關(guān)，有氧絹化型歷和還途原型將兩種塌成分，磺煌胺乙絕?；婪y豆得的炎是制睜劑中Co讓A的總耗效價(jià)§5畜.8從啤葛酒酵禽母中華提取RN餃A工業(yè)讓制取RN椅A