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學(xué)必求其心得,業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得,業(yè)必貴于專精PAGEPAGE1學(xué)必求其心得,業(yè)必貴于專精課時(shí)作業(yè)(十八)胚胎工程與生態(tài)工程1.(2017·江西)生長激素是治療侏儒癥的特效藥,但人體產(chǎn)生的生長激素的量比較少。利用牛的乳腺生產(chǎn)人的生長激素,可以提高生長激素的生產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本,滿足患者的需求。請(qǐng)回答下列相關(guān)問題:(1)人的生長激素基因________(填“能"或“不能")通過mRNA來生產(chǎn)。要想獲得大量的人生長激素基因可采用PCR用技術(shù)來擴(kuò)增,其前提條件是________,其原料為______________________.(2)基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建,其目的是____________________________________________________________________________________________________________________。(3)采用________法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入奶牛的受精卵中,然后體外培養(yǎng)到________(時(shí)期),挑選________(部位)的細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定,選擇性染色體為XX的胚胎進(jìn)行胚胎移植。(4)判斷人的生長激素基因在奶牛體內(nèi)是否表達(dá)的方法為________。答案(1)不能要有一段已知目的基因的核苷酸序列用來合成引物dATP、dGTP、dCTP、dTTP(或4種脫氧核糖核苷酸)(2)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在且能遺傳給下一代,使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用(3)顯微注射囊胚期滋養(yǎng)層(4)抗原—抗體雜交法(或檢測(cè)奶牛的乳汁中是否存在人的生長激素)解析(1)由mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄的方法產(chǎn)生的目的基因中不含啟動(dòng)子和終止子,所以不能產(chǎn)生人的生長激素基因.采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物.PCR技術(shù)的原料為4種dNTP,即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。(2)基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建,其目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在且能遺傳給下一代,使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用。(3)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞采用顯徽注射法。在囊胚期挑選滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行胚胎的性別鑒定。(4)檢測(cè)奶牛的乳汁中是否存在人的生長激素可用來判斷人的生長激素基因在奶牛體內(nèi)是否表達(dá),具體方法為抗原一抗體雜交法。2.(2017·延邊州一模)如圖為培育轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)人β-酪蛋白的流程圖,請(qǐng)回答下列問題。(1)獲取過程①所用的人β-酪蛋白基因時(shí),可先提取人體細(xì)胞中的________,以其作為模板在________作用下合成________.(2)重組人β-酪蛋白基因表達(dá)載體中必須有啟動(dòng)子,其是________識(shí)別和結(jié)合的部位。(3)過程②可選用________階段的胚胎進(jìn)行移植。(4)過程③可使用________技術(shù)擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因山羊群體。(5)過程④中的β-酪蛋白基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的場(chǎng)所為________,在分子水平上可通過________技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊中是否成功表達(dá)出人β-酪蛋白。答案(1)β-酪蛋白的mRNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA(或DNA)(2)RNA聚合酶(3)桑椹胚(或囊胚)(4)胚胎分割(5)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)抗原-抗體雜交解析(1)目的基因的獲取包括:從基因文庫中獲取、PCR技術(shù)擴(kuò)增、人工合成等,其中人工合成的方法中包括反轉(zhuǎn)錄法,即可先從人體細(xì)胞中提取β-酪蛋白的mRNA,以其作為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA(或DNA)。(2)重組人β一酪蛋白基因表達(dá)載體中必須有啟動(dòng)子,它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位.(3)過程②為胚胎移植,一般選用發(fā)育良好、形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚進(jìn)行移植.(4)過程③可使用胚胎分割技術(shù)擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因山羊群體.(5)基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段,其中β一酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,而翻譯發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上,檢測(cè)目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)可采用抗原-抗體雜交技術(shù).3.(2017·宜春二模)為進(jìn)行牛胚胎移植,可通過下列途徑獲得優(yōu)良胚胎,請(qǐng)回答相關(guān)問題:(1)在途徑①中,為一次性獲得數(shù)目較多的胚胎,可用激素對(duì)供體母牛做________處理。在自然條件下,受精是在雌性的________內(nèi)完成的;若進(jìn)行體外受精,應(yīng)使用培養(yǎng)到________的卵母細(xì)胞。(2)在途徑②中,用于核移植的供體細(xì)胞一般選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞,原因是________;動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)至數(shù)量達(dá)到一定程度后出現(xiàn)________現(xiàn)象而使細(xì)胞停止分裂,需用胰蛋白酶處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。(3)在途徑③中,將目的基因?qū)胧芫?,并且在其?nèi)________的過程,稱為轉(zhuǎn)化.(4)進(jìn)行胚胎移植的優(yōu)勢(shì)是________。欲獲得遺傳物質(zhì)完全相同的兩個(gè)后代,可選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的________進(jìn)行胚胎分割。答案(1)超數(shù)排卵輸卵管減數(shù)第二次分裂中期(2)具有正常的二倍體核型接觸抑制(3)維持穩(wěn)定和表達(dá)(4)充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個(gè)體的繁殖潛力桑椹胚或囊胚解析(1)為了一次性獲得數(shù)目較多的胚胎,可用激素對(duì)供體母牛做超數(shù)排卵處理。在自然條件下,受精是在雌性的輸卵管內(nèi)完成的;若進(jìn)行體外受精,應(yīng)使用培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞。(2)用于核移植的供體細(xì)胞一般選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞,原因是具有正常的二倍體核型,即核內(nèi)的遺傳物質(zhì)一般沒有發(fā)生改變,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)至數(shù)量達(dá)到一定程度后出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象而使細(xì)胞停止分裂,需用胰蛋白酶處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。(3)將目的基因?qū)胧芫眩⑶以谄鋬?nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程,稱為轉(zhuǎn)化。(4)進(jìn)行胚胎移植的優(yōu)勢(shì)是充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個(gè)體的繁殖潛力。進(jìn)行胚胎分割的早期胚胎可選擇發(fā)育良好、形態(tài)正常的桑椹胚或囊胚。4.(2017·寧城縣一模)2013年7月,中國試管嬰兒之母--盧光現(xiàn)教授與研究伙伴共同宣布全球首批經(jīng)全基因組測(cè)序的PGD/PGS試管嬰兒在長沙誕生,新技術(shù)的突破意味著通過設(shè)計(jì)試管嬰兒解決部分不孕不育問題的同時(shí),部分腫瘤疾病、遺傳性疾病的家族性遺傳也將有望避免.(1)設(shè)計(jì)試管嬰兒時(shí)為了提高受孕率,胚胎移植時(shí)多采用多胚胎移植,因此需用________處理促進(jìn)母親排出更多的卵子.(2)胚胎發(fā)育的卵裂期在________(填“透明帶”或“放射冠”)內(nèi)進(jìn)行,受精卵經(jīng)72小時(shí)體外培養(yǎng)發(fā)育成32細(xì)胞左右的胚胎,叫做________,可用于胚胎移植。(3)為了某些需要,需對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定,目前最有效最準(zhǔn)確的方法是SRY-PCR法,操作的基本程序是:從被測(cè)的囊胚中取出幾個(gè)________(填“滋養(yǎng)層"或“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)”)細(xì)胞,提取DNA為模板;然后用位于Y染色體上的性別決定基因(即SRY基因)的一段核苷酸序列作________,在________________催化作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增;最后與SRY特異性探針出現(xiàn)陽性反應(yīng)者,胚胎為________性。(4)設(shè)計(jì)試管嬰兒、克隆人等都是引起人們廣泛爭(zhēng)論的問題,我國不反對(duì)治療性克隆,即可利用人體細(xì)胞核移植等技術(shù)治療人類疾病,在去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核時(shí),可用微型吸管把位于__________________之間的第一極體一并吸出。答案(1)促性腺激素(2)透明帶桑椹胚(3)滋養(yǎng)層引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)(只答DNA聚合酶不得分)男(4)卵細(xì)胞膜與透明帶解析(1)給良種母畜注射促性腺激素可促使其超數(shù)排卵。(2)胚胎發(fā)育的卵裂期是在透明帶內(nèi)進(jìn)行的,經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育成的32細(xì)胞的胚胎,形似桑椹,叫做桑椹胚,可用于胚胎移植。(3)目前,對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定的最有效最準(zhǔn)確的方法是SRY-PCR法,操作的基本程序是:從被測(cè)的囊胚中取出幾個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞,提取DNA;然后用位于Y染色體上的性別決定基因(即SRY基因)的一段堿基作引物,在熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)催化作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,與SRY特異性探針出現(xiàn)陽性反應(yīng)者,說明其含有Y染色體,為男性.(4)治療性克隆是指利用人體細(xì)胞核移植等技術(shù)治療人類疾病,在去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核時(shí),可用微型吸管把位于卵細(xì)胞膜和透明帶之間的第一極體一并吸出.5.(2017·煙臺(tái)模擬)用醫(yī)學(xué)手段培育“三親嬰兒”可以解決遺傳基因帶來的缺陷,其培養(yǎng)過程如圖所示,請(qǐng)據(jù)圖回答有關(guān)問題:(1)由于女性的自然周期產(chǎn)生的卵子太少,捐獻(xiàn)者在取卵前需要注射________激素,促使一次有更多的卵泡發(fā)育,重組細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的氣體主要是O2和CO2,CO2的主要作用是____________.(2)從受精卵到三親嬰兒的培養(yǎng)還需要____________和________等技術(shù),三親嬰兒的培育方式屬于________生殖.(3)三親嬰兒的培育技術(shù)________(填“能”或“不能”)避免母親的線粒體遺傳病基因傳遞給后代,三親嬰兒的染色體________(填比例)來自母親提供的細(xì)胞核,設(shè)計(jì)試管嬰兒技術(shù)與為解決不孕夫婦的生育問題而出現(xiàn)的試管嬰兒技術(shù)主要區(qū)別是植入前對(duì)胚胎進(jìn)行____________________________。答案(1)促性腺維持培養(yǎng)液的PH(2)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植有性(3)能eq\f(1,2)遺傳學(xué)診斷(或基因檢測(cè)或基因診斷)解析(1)對(duì)雌性供體注射促性腺激素,使其超數(shù)排卵,獲得更多的卵細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)環(huán)境需要一定氣體環(huán)境,其中CO2的主要作用維持培養(yǎng)液的pH.(2)三親嬰兒的培育需要核移植、體外受精、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植等技術(shù),根據(jù)圖示可推測(cè):三親嬰兒由受精卵發(fā)育而來的個(gè)體,培育方式屬于有性生殖.(3)根據(jù)圖示可知卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)來自于捐獻(xiàn)者,可避免母親的線粒體遺傳基因傳遞給后代,三親嬰兒的染色體eq\f(1,2)來自母親和eq\f(1),\s\do5(2))來自父親提供的細(xì)胞核,設(shè)計(jì)試管嬰兒技術(shù)在胚胎移植前需要進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,而試管嬰兒技術(shù)不需要。6.(2017·渭南二模)如圖為轉(zhuǎn)基因奶牛和轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的培育過程,請(qǐng)回答相關(guān)問題:(1)A為目的基因,可通過PCR技術(shù)擴(kuò)增,該技術(shù)的原理是______________,在PCR反應(yīng)體系中應(yīng)含有擴(kuò)增緩沖液、4種原料、模板DNA、引物及______________________。(2)⑤過程所用的技術(shù)為________________,原理是植物細(xì)胞的全能性,其根本原因是此細(xì)胞含有______________________,在構(gòu)建重組質(zhì)粒B過程中,目的基因兩端還必須有__________________和終止子,用含重組質(zhì)粒的土壤農(nóng)桿菌感染水稻細(xì)胞后,采用____________________技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻的染色體DNA上是否插入了目的基因。(3)培育轉(zhuǎn)基因奶牛過程中,②過程常用的方法是______________,其中④過程用到的胚胎工程技術(shù)有____________________.答案(1)DNA的雙鏈復(fù)制熱穩(wěn)定DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)(2)植物組織培養(yǎng)發(fā)育成完整個(gè)體的全部遺傳物質(zhì)啟動(dòng)子DNA雜交技術(shù)(3)顯微注射法早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植解析(1)PCR的原理是DNA的雙鏈復(fù)制,在PCR反應(yīng)體系中應(yīng)含有擴(kuò)增緩沖液、4種原料、模板DNA、引物及熱穩(wěn)定DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。(2)⑤過程中將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因植株需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù),其原理是植物細(xì)胞具有全能性,根本原因是此細(xì)胞含有發(fā)育成完整個(gè)體的全部遺傳物質(zhì),基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、目的基因、標(biāo)記基因和終止子,因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒B過程中,目的基因兩端還必須有啟動(dòng)子和終止子,檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可采用DNA雜交技術(shù)。(3)②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法,④過程用到的胚胎工程技術(shù)有早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植。7.(2017·淮南二模)下圖是利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)血清白蛋白的過程圖解,據(jù)圖回答:(1)在基因工程中,我們獲取血清白蛋白基因的主要方法有________(至少答兩種)。圖中①過程為構(gòu)建基因表達(dá)載體,這是基因工程的核心,除目的基因外,基因表達(dá)載體還必須含有________,圖中③過程常用方法是__________________.(2)圖中過程涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)中,屬于細(xì)胞工程的有________(填名稱)。(3)過程④一般利用未受精的卵母細(xì)胞去核后作為受體細(xì)胞,對(duì)卵母細(xì)胞的去核處理一般選擇在________時(shí)期進(jìn)行。(4)將早期胚胎培養(yǎng)至________階段移入代孕母牛子宮內(nèi)。如果需要進(jìn)行性別鑒定,則在B所在的時(shí)期取________細(xì)胞進(jìn)行鑒定,這是因?yàn)樵摬课坏募?xì)胞與將來發(fā)育成新個(gè)體的________都來自同一個(gè)受精卵。答案(1)基因文庫中提取、人工化學(xué)合成、PCR技術(shù)擴(kuò)增啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因顯微注射法(2)核移植技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(3)MⅡ/減數(shù)第二次分裂(4)囊胚或桑椹胚滋養(yǎng)層內(nèi)細(xì)胞團(tuán)解析分析圖中流程:①是基因表達(dá)載體的構(gòu)建,②用胰蛋白酶處理奶牛成塊組織形成單個(gè)細(xì)胞,③是將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,④是將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞,⑤是早期胚胎培養(yǎng),⑥是胚胎移植。(1)在基因工程中,獲取目的基因的主要方法有基因文庫中提取、人工化學(xué)合成、PcR技術(shù)擴(kuò)增。圖中①過程為構(gòu)建基因表達(dá)載體,除目的基因外,還必須含有啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因。圖中③過程是將目的基因?qū)胧荏w動(dòng)物細(xì)胞,常用方法是顯微注射法。(2)圖中過程涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)中,屬于細(xì)胞工程的有核移植技術(shù)④和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。(3)過程④中,能接受細(xì)胞核的去核卵母細(xì)胞,一般選擇在MⅡ/減數(shù)第二次分裂時(shí)期進(jìn)行。(4)將早期胚胎培養(yǎng)至囊胚或桑椹胚階段移入代孕母牛子宮內(nèi)。進(jìn)行性別鑒定,需要取囊胚時(shí)期的滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行鑒定,這是因?yàn)樵摬课坏募?xì)胞與將來發(fā)育成新個(gè)體的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)都來自同一個(gè)受精卵,所含的遺傳物質(zhì)或者性染色體組成相同.8.(2017·甘肅模擬)我國全面放開二孩政策可緩解我國低生育率及人口老齡化帶來的問題,“試管嬰兒技術(shù)”可為不孕夫婦重新獲得生育的機(jī)會(huì),回答下列問題:(1)試管嬰兒技術(shù)主要用到了胚胎工程和細(xì)胞工程中的________________________技術(shù),(答出2項(xiàng)即可)(2)自然條件下,初級(jí)卵母細(xì)胞的減數(shù)第一次分裂是在排卵前后完成的,產(chǎn)生一個(gè)__________________和第一極體,進(jìn)入輸卵管,準(zhǔn)備與精子受精,當(dāng)在__________________的間隙可以觀察到兩個(gè)極體時(shí),說明卵子已經(jīng)完成了受精.(3)為保證有可以移植的、有活力的胚胎,需要對(duì)女性進(jìn)行促排卵處理,一般需給母親注射______________________,使其排出更多的卵子,卵子需培養(yǎng)至____________________時(shí)期才具備受精能力。(4)受精卵經(jīng)過卵裂可以發(fā)育成早期胚胎,卵裂實(shí)際上是細(xì)胞的________分裂,在胚胎發(fā)育的________階段前的每一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成完整胚胎的潛能.(5)紅綠色盲癥為伴X染色體隱性遺傳病,一對(duì)夫婦中丈夫正常,妻子為紅綠色盲基因攜帶者,胚胎移植前胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,用位于Y染色體上的性別決定基因制成DNA探針,分別從胚胎甲、乙上分離細(xì)胞并提取DNA,與該探針雜交,發(fā)現(xiàn)胚胎甲有雜交帶,胚胎乙無雜交帶,為使后代不患紅綠色盲癥,適合移植的胚胎是________。答案(1)體外受精、胚始移植、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、早期胚始培養(yǎng)(2)次級(jí)卵母細(xì)胞卵細(xì)胞膜和透明帶(3)促性腺激素減數(shù)第二次分裂中期(4)有絲桑椹胚(5)乙解析(1)試管嬰兒技術(shù)是指通過人工操作使卵子和精子在體外條件下成熟和受精,并通過培養(yǎng)發(fā)育為早期胚胎后,然后從中篩選出符合要求的胚胎,再經(jīng)移植產(chǎn)生后代的技術(shù),試管嬰兒技術(shù)主要用到了胚胎工程中的體外受精、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞工程的細(xì)胞培養(yǎng).(2)自然條件下,初級(jí)卵母細(xì)胞的減數(shù)第一次分裂是在排卵前后完成的,產(chǎn)生一個(gè)次級(jí)卵母細(xì)胞和第一極體,進(jìn)入輸卵管,準(zhǔn)備與精子受精,當(dāng)在卵細(xì)胞膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個(gè)極體時(shí),標(biāo)志著卵子已經(jīng)完成了受精。(3)一般需給母親注射促性腺激素,使其超數(shù)排卵,卵子需培養(yǎng)至減數(shù)第二次分裂中期時(shí)才具備受精能力。(4)卵裂是細(xì)胞的有絲分裂,卵裂時(shí)細(xì)胞通過有絲分裂方式;在胚胎發(fā)育的桑椹胚階段前的每一個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育成完整胚胎的潛能,到了囊胚階段細(xì)胞開始分化,其中只有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)具有發(fā)育成完整胚胎的潛能.(5)紅綠色盲癥為伴X染色體隱性遺傳病,某夫婦中丈夫正常,妻子為紅綠色盲基因攜帶者,則他們所生子女中,女兒都正常,兒子有一半的概率會(huì)患紅綠色盲癥,在移植前需對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,用位于Y染色體上的性別決定基因制成DNA探針,分別從胚胎甲、乙上分離細(xì)胞并提取DNA,與探針雜交,發(fā)現(xiàn)胚胎甲有雜交帶,則甲為男孩,胚胎乙無雜交帶,則乙為女孩,因此,為使后代不患紅綠色盲癥,適合進(jìn)行移植的胚胎是乙。9.(2016·江蘇兩市一模)我國南方某地環(huán)保部門向遭受嚴(yán)重污染的南湖中引入苦草、黑藻等沉水植物和螺螄等底棲動(dòng)物來修復(fù)該生態(tài)系統(tǒng)。如圖為該生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)后的部分生物的營養(yǎng)關(guān)系,請(qǐng)據(jù)圖回答問題:(1)在修復(fù)該生態(tài)系統(tǒng)時(shí)要控制污水流入的速率,除了有利于有機(jī)污染物被充分分解外,還有利于植物對(duì)________的充分吸收,防止水體富營養(yǎng)化。該生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)后物種豐富度逐漸增加,其群落演替類型是________.(2)調(diào)查野鴨的種群密度常用________法。當(dāng)螺螄數(shù)量增加時(shí),草魚和羅非魚數(shù)量也會(huì)增多,這樣,螺螄種群的增長就會(huì)受到抑制,

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