水蛭素融合蛋白研究進(jìn)展

水蛭素融合蛋白研究進(jìn)展【摘要】水蛭素是一種高效特異的凝血酶抑制劑，臨床上用于血栓病的預(yù)防和治療，但它半衰期短、出血副作用強(qiáng)和功能單一。近年來(lái)，通過(guò)把水蛭素與某些功能蛋白融合表達(dá)來(lái)解決這些問(wèn)題，得到的融合蛋白或在體內(nèi)延長(zhǎng)水蛭素的半衰期，或降低其出血副作用，或帶來(lái)新的功能，如：溶栓、抑制血小板凝集、特異尋靶等。本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外水蛭素融合蛋白研究狀況進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】水蛭素融合蛋白抗凝血栓形成

ResearchProgressinHirudinFusionProtein——Review

AbstractNaturalhirudinextractedfromthesecretionofmedicalleechsalivaryglandisasinglechainpeptidecontaining65aminoacidresidueswithmolecularweightof7000D,andexistsinthreeisomersofHV1,HV2andHV3.Hirudinpossessesthreedisulfidebridgesformingthestructureofcorecyclicpeptides,whichbindstothecatalyticsiteofthrombinsoastoinhibitthecatalysisofthrombin.Itscterminusrichinacidicaminoacidresiduespossesseshydrophilicity,andisfreeonthemolecularsurface,andcanbindwithfibrinrecognitionsiteofhirudin.Theminimalsegmentof12-16Cterminalacidicresidueskeepstheminimalactivityofantithrombosis.Thus,hirudin,asapotentandspecificinhibitorofthrombin,canbeusedtoprotectfromandtotreatclinicallythrombosis.Asithassomedisadvantagessuchasshorthalflife,bleedingsideeffectandmonofunction,andsoon,hirudinhasbeenfusedwithsomeotherfunctionalproteinsinrecentyears.Theobtainedfusionproteinscanprolongthehalflifeofhirudin,orrelieveitbleedingsideeffect,orbringnewfunctions,suchasthrombolysis,inhibitingtheplateletaggregation,targethingspecifically.Theresearchprogressinhirudinfusionproteinwassummarizedinthisreview.

Keywordshirudin；fusionprotein；anticoagulation；thrombosis

當(dāng)今心血管疾病已成為危害人類健康的頭號(hào)敵人，其中血栓的形成是引起心腦血管疾病的重要原因。水蛭素是近年來(lái)研制開(kāi)發(fā)的新一代抗凝蛋白藥物，被用于血栓病的預(yù)防和治療，其效果明顯優(yōu)于肝素，而又無(wú)肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥［1］。但是水蛭素作為一種小分子蛋白藥物，同樣具有在體內(nèi)代謝快，半衰期短的缺點(diǎn),通過(guò)把水蛭素與輔助多肽融合表達(dá)，就可以使水蛭素在人體內(nèi)緩慢釋放，延長(zhǎng)半衰期；水蛭素只有抗凝作用，而沒(méi)有溶栓功能，通過(guò)與其他溶栓蛋白融合表達(dá)，就可以得到抗凝溶栓雙功能蛋白藥物，將更有效的溶解血凝塊并抑制新血栓的形成；水蛭素在體內(nèi)有廣泛的抑制凝血酶作用，當(dāng)水蛭素的劑量大于抗凝所需的劑量時(shí)，就會(huì)發(fā)生明顯的出血現(xiàn)象，通過(guò)與纖維蛋白特異抗體融合，就使得水蛭素在血栓部位富集，有效的發(fā)揮抗凝功能，從而避免全身的出血副作用。另外，水蛭素與其他抗凝成分結(jié)合，就會(huì)從多個(gè)途徑阻斷血栓的形成，更高效的起到抗栓效果。近年來(lái)，許多人將3種或以上的抗凝成分同時(shí)融合在一個(gè)分子中，且表明能夠產(chǎn)生更為有效和更有針對(duì)性的化合物，這種嵌合分子代表了抗凝藥物研制的一個(gè)新的方向。

長(zhǎng)效緩釋型水蛭素

水蛭素是一種多肽藥物，當(dāng)以游離形式進(jìn)入體內(nèi)后，被體內(nèi)豐富的蛋白酶切割而失活；另外，水蛭素分子量只有7000kD左右，在體內(nèi)會(huì)很快地被腎小球?yàn)V過(guò)，再經(jīng)尿液排出［2］。若要水蛭素能夠長(zhǎng)效緩釋，就要想法屏蔽掉水蛭素上蛋白酶敏感位點(diǎn)，或增大分子量，降低腎小球?yàn)V過(guò)率。圍繞這個(gè)思路，有些科研人員做了許多有意義的嘗試。

Wirsching等［3］對(duì)水蛭素蛋白酶敏感位點(diǎn)進(jìn)行突變，篩選抗酶切的活性突變體，不過(guò)這種方法很難適應(yīng)人體內(nèi)眾多的蛋白酶。Avgerinos等［4］通過(guò)PEG對(duì)蛋白酶敏感位點(diǎn)進(jìn)行修飾，不但抑制蛋白水解酶的降解，而且增大蛋白分子量，降低腎小球通過(guò)率，使得藥物半衰期得以延長(zhǎng)，在臨床上就可以降低使用劑量或減少注射頻率。不過(guò)，PEG修飾蛋白的過(guò)程不易控制。Syed等［5］為了使水蛭素在保持高效抗凝活性的同時(shí)，延長(zhǎng)血漿半衰期。他們大膽假設(shè)水蛭素與白蛋白基因融合能夠達(dá)到這一目的，并設(shè)計(jì)了兩個(gè)融合蛋白：HV3經(jīng)C末端與白蛋白相連和HV3經(jīng)N末端與白蛋白相連。實(shí)驗(yàn)證明，HLA不但保留著抑制凝血酶的性質(zhì)，還保留兔血清白蛋白染料接合的特性。通過(guò)顯色底物法分析，40nmol/L的HV1與30nmol/L的HLA具有相同的結(jié)果，這表明融合蛋白HLA對(duì)凝血酶有高親和抑制能力。純化后HLA注入兔子體內(nèi)，代謝半衰期達(dá)到±天，而水蛭素的半衰期只有小時(shí)。這些結(jié)果表明，利用基因融合的策略來(lái)延長(zhǎng)抗凝蛋白的半衰期是可行的、有效的。

目前，臨床常用的溶栓蛋白有葡激酶、鏈激酶、尿激酶組織型纖溶酶原激活劑。單純使用這些溶栓藥物容易發(fā)生溶栓后再栓塞，臨床上采用給予溶栓藥物的同時(shí)給予抗凝藥物能有效地防止再栓塞的發(fā)生，這已經(jīng)在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中和100000名患者身上得到驗(yàn)證［6，7］。為更充分發(fā)揮溶栓和抗凝藥物的優(yōu)勢(shì)，將二者融合表達(dá)，就可以得到抗凝溶栓雙功能蛋白藥物，將更有效的溶解血凝塊并抑制新血栓的形成。目前，有許多新型溶栓抗凝雙功能融合蛋白藥物正在研制開(kāi)發(fā)中。

纖溶酶原激活劑葡激酶是治療心肌梗死的溶栓良藥，它不但能夠有效地溶解富含紅細(xì)胞的凝血塊，還能夠有效溶解富含血小板的凝血塊。但是SAK不能抑制凝血酶的活性，而這個(gè)性質(zhì)能大大提高SAK的溶栓潛能。Szarka等［8］分別在SAK的C端和N端與水蛭素融合，SAK的纖溶酶原激活特性沒(méi)有因?yàn)榕c水蛭素融合而改變。SAK表面呈高度不均衡的親水性、疏水性，而N端的15個(gè)氨基酸游離在球體外，非常柔韌，在SAK與PLG形成復(fù)合物時(shí)，SAK去掉N端的10個(gè)氨基酸。所以HV1SAK進(jìn)入體內(nèi)很快就被纖溶酶切開(kāi)，游離為HVSAK和SAK。這樣就無(wú)法體現(xiàn)融合蛋白的功能，HV1SAK也就毫無(wú)意義了，而SAKHV1比HV1SAK更能耐受纖溶酶的降解?？赡苁俏∫陨涎芯康慕?jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)，Lian等［9］通過(guò)一個(gè)coiledcoil序列將SAK和HV構(gòu)建成一個(gè)Y形異源二聚體，從而保證了SAK和HV都具有游離的N末端而不影響各自的功能。該研究顯示，融合蛋白不僅很好的保持了溶栓和抗凝活性，而且HV的C末端對(duì)凝血酶的親和性還使融合蛋白對(duì)富含纖維蛋白的血栓具有一定的靶向性。

另外，本實(shí)驗(yàn)室成功地構(gòu)建了tPA和HV的融合蛋白基因，并將其導(dǎo)入了畢赤酵母，獲得了有活性的表達(dá)產(chǎn)物(TFXH)。在構(gòu)建融合蛋白基因時(shí)將水蛭素置于tPA下游，主要基于以下考慮：在融合蛋白不被裂解的情況下，水蛭素N端被封閉，其抗凝活性喪失，可減少出血副作用的發(fā)生；同時(shí)利用融合蛋白中游離的水蛭素C端對(duì)凝血酶的高親和力，增加TFXH對(duì)血栓的靶向性，提高溶栓效率。但在畢赤酵母中TFXH的表達(dá)量較低，雖經(jīng)發(fā)酵條件的優(yōu)化，但表達(dá)量未見(jiàn)顯著提高，這成為了限制對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的嚴(yán)重障礙［10］。

靶向型水蛭素

高濃度的水蛭素能有效地抑制凝血酶，但伴隨著常見(jiàn)的出血綜合癥。一個(gè)戰(zhàn)略性的解決此問(wèn)題的方法就是讓水蛭素能夠?qū)ぐ欣w維蛋白，使水蛭素只在血栓部位發(fā)揮抗凝功能，從而避免全身出血的風(fēng)險(xiǎn)。Bode等［11］將纖維蛋白抗體與水蛭素通過(guò)化學(xué)的方法偶聯(lián)起來(lái)。這個(gè)化學(xué)偶聯(lián)物能夠有效的抑制血塊實(shí)驗(yàn)中纖維蛋白的沉積，同時(shí)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗栓效果［12］。不過(guò)，這種化學(xué)偶聯(lián)物也有幾個(gè)缺點(diǎn)，最主要的是產(chǎn)量過(guò)低和連接過(guò)程中水蛭素部分活性的損失。水蛭素需要自由的N端和C端才能有抗凝活性，直接地在水蛭素的一端連上單克隆抗體，將導(dǎo)致水蛭素活性的消失。為了解決這些問(wèn)題，Peter等［13，14］通過(guò)重組的方法將Fxa識(shí)別序列引入到纖維蛋白單克隆抗體和HV之間，這樣融合蛋白被單克隆抗體帶到血栓的纖維蛋白處后，由此處富含的Fxa斷開(kāi)，釋放HV的N自由端，在血栓部位發(fā)揮強(qiáng)抗凝活性，而不引起全身的出血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該融合蛋白能在體外被FXa裂解并表現(xiàn)出抗凝活性，但進(jìn)入體內(nèi)后是否會(huì)產(chǎn)生靶向性的抗凝從而減少出血的可能，這一點(diǎn)還未得到證實(shí)。

多功能復(fù)合型水蛭素

近年來(lái)，為了尋求更好的抗凝溶栓效果，并盡可能的降低其副作用，科研人員不再單純的圍繞一兩個(gè)抗凝溶栓分子做文章了，而是擴(kuò)大視野范圍，囊括了幾乎所有的抗凝溶栓分子或與其有關(guān)的重要分子，并通過(guò)基因重組的方式將它們巧妙地連接起來(lái)，期望發(fā)揮它們的協(xié)同作用，或是產(chǎn)生新的功能。

Walda等［15］將抗血小板、抗凝血酶成分和SAK連成為融合蛋白PLATSAK(antipateletantithrombinSAK),SAK位于N端，與RGD序列序列通過(guò)Fxa斷裂位點(diǎn)連接，接著是纖維蛋白肽A的8-16位殘基，它的C端是水蛭素的54-65位殘基。由于SAK的纖維蛋白特異性，PLATSAK可到達(dá)纖維蛋白塊，也就是Fxa的富集環(huán)境，F(xiàn)xa裂解PLATSAK，釋放出抗血小板抗凝血酶成分，它包括3部分：一是RGD序列，它與纖維蛋白原受體結(jié)合，抑制血小板聚集；二是纖維蛋白A片段，它能抑制凝血酶活性位點(diǎn)；三是C端的水蛭素片段，它能結(jié)合并阻斷凝血酶的陰離子結(jié)合位點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)中，PLATSAK可明顯抑制凝血酶活性，并可以激活纖溶酶原，其纖溶能力與重組SAK幾乎相同，但其抗血小板凝集能力并不顯著，這可能是因?yàn)镽GD序列被埋在融合蛋白分子內(nèi)部的緣故。但在狒狒的動(dòng)靜脈的模型中，PLATSAK卻可以使血小板的沉積，這也說(shuō)明作者采用的這種融合策略是成功的［16］。Walda等［15］大膽地選用溶栓蛋白、抗凝蛋白、抗血小板三肽、纖維蛋白肽A作為新蛋白的素材，并且不是將幾個(gè)完整的蛋白簡(jiǎn)單地拼結(jié)起來(lái)，而是選用蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，這樣不但可以多引入幾個(gè)功能，而且還不至于過(guò)分增大融合蛋白的分子量，增強(qiáng)融合蛋白的免疫原性。在功能域之間作者巧妙地將Fxa識(shí)別序列作為連接子，這樣一方面避免兩蛋白在空間上相互影響，另一方面使得融合蛋白特意地在血栓部位裂解開(kāi)來(lái)，釋放出活性。這個(gè)融合蛋白給我們兩點(diǎn)啟發(fā)：第一，在分析我們的研究對(duì)象時(shí)候，一定要抓住它的特性，并巧妙的利用它；第二，對(duì)現(xiàn)有的東西進(jìn)行優(yōu)勢(shì)組合，可以創(chuàng)造出更高效的新發(fā)明。

融合蛋白最大的難點(diǎn)就是如何能保證各組分在融合之后仍然保持原來(lái)的活性。這與各組分的連接順序和連接子的設(shè)置有很大關(guān)系，連接之后是否還需要在病灶部位斷開(kāi)，這些都是要仔細(xì)思考，精心設(shè)計(jì)的。做融合蛋白希望通過(guò)各組分優(yōu)勢(shì)組合達(dá)到效益的最大化，但是也會(huì)出現(xiàn)副作用集中放大的可能，所以要在藥效和藥物副作用之間選取一個(gè)平衡點(diǎn)，為了達(dá)到這個(gè)目的國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者做著類似的努力。像Bi等［17］同樣設(shè)計(jì)兩個(gè)多功能融合蛋白scuPA(32k)linkerHir(residues53-65)RGD和hirudin(residues1-33)RGDSPhirudin(residues34-65)scuPA(32k)。這兩個(gè)融合蛋白不但有纖溶酶原激活能力，還有抑制血小板聚集和抗凝血酶的能力。在第一個(gè)融合蛋白中scuPA依然保持其生物學(xué)活性，它的纖維蛋白溶解能力和氨基溶解的能力要比第二個(gè)高，這可能是因?yàn)閟cuPA通過(guò)linker與hir相連，沒(méi)有影響到scuPA的天然構(gòu)象。據(jù)報(bào)道，水蛭素C端12肽的抗凝活性只有天然水蛭素的2％，所以第一個(gè)融合蛋白的抗凝活性比較低。由于這兩個(gè)融合蛋白對(duì)纖維蛋白和血小板有親和性，所以在體內(nèi)能夠直接定向血栓，這樣就會(huì)降低出血的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，與凝血酶結(jié)合后，暴露出RGD序列，能夠有效的預(yù)防再栓塞。但是，這兩個(gè)融合蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的情況還需要進(jìn)一步的研究。Szemraj等［18］構(gòu)建了具有溶栓、抗栓、抗血小板和纖維蛋白特異結(jié)合能力的多功能融合蛋白，包括：①葡激酶SAK；②抑制血小板聚集的RGD序列；③tPA與纖維蛋白特異結(jié)合的K2結(jié)構(gòu)域；④水蛭素(Hir)，組合起來(lái)就是：SAKRGDK2Hir，但其確切功能還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。Zhang等［19］將一種血小板抑制劑，低分子量單鏈尿激酶和凝血酶抑制結(jié)構(gòu)域融合在一起。研究發(fā)現(xiàn)，該融合蛋白對(duì)ADP引起的血小板聚集具有靶向抑制作用，同時(shí)還具有抗血栓的功能。

基于現(xiàn)有藥物的二次創(chuàng)新，就要突破原有藥物的專利束縛，只有受專利保護(hù)的新藥才能在市場(chǎng)上有強(qiáng)勁的生命力。上海復(fù)旦大學(xué)宋后燕教授從水蛭素晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在32-35殘基位置引入RGD序列更為合理，得到的水蛭素衍生物具有更強(qiáng)大的抗血小板和抗凝活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，RGDhirudin的有效劑量只有水蛭素的一半，但是該藥依然沒(méi)有解決水蛭素的強(qiáng)出血副作用的致命缺點(diǎn)，且其出血傾向比同劑量的水蛭素還要大一些。為此，作者巧妙地對(duì)水蛭素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，突破國(guó)外水蛭素的專利束縛，創(chuàng)造出了一個(gè)更高效的一類抗凝藥物，堪稱二次創(chuàng)新的成功典范。目前該藥已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段［20］。

在目前的抗凝新藥研究領(lǐng)域，要開(kāi)發(fā)出一個(gè)全新的抗凝新藥是十分困難的，大家的研究熱點(diǎn)大都集中在對(duì)現(xiàn)有藥物的改造或是對(duì)其優(yōu)勢(shì)的組合上，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手，發(fā)揮更大的藥物療效，同時(shí)想方設(shè)法降低藥物的毒副作用，一般很難同時(shí)兼顧這兩點(diǎn)，只能在利與弊之間選取一個(gè)合適的平衡點(diǎn)?，F(xiàn)有抗凝藥物的抗凝效果都還比較理想，但是大都存在同樣的致命缺點(diǎn)就是出血副作用強(qiáng)，目前幾乎不存在一個(gè)無(wú)出血傾向的高效抗凝藥物。因此，急需創(chuàng)造出一個(gè)安全型的抗凝新藥。

研究展望

近年來(lái)的研究表明，許多抗凝、溶栓、尋靶成分具有互補(bǔ)和協(xié)同作用，利用融合蛋白技術(shù)將他們組合連接，產(chǎn)生的水蛭素融合蛋白可能較單一的或聯(lián)合使用具有更好的復(fù)合活性，甚至產(chǎn)生新的活性。融合蛋白藥物的出現(xiàn)解決了使用單一蛋白的缺點(diǎn)和問(wèn)題。相信隨著生物學(xué)，基因工程研究的不斷深入，人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，蛋白質(zhì)分子間相互作用的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高，融合蛋白技術(shù)的應(yīng)用也愈來(lái)愈廣泛。

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15vanZylWB,PretoriusGH,Hartm