DB35T 1219-2011大豆疫霉菌土壤誘捕技術(shù)規(guī)程

ICS65.020ICS65.020B16DB35福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T1219—2011大豆疫霉菌土壤誘捕技術(shù)規(guī)程TechnicalstandardforbaitingPhytophthorasojaefromsoil2011-12-31發(fā)布 2012-03-15實(shí)施福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IIDB35/T1219—2011目次TOC\o"1-5"\h\z前言 II1范圍 12術(shù)語(yǔ)和定義 1土壤誘捕方法 13.1 誘捕方法 1土樣采集及處理 1大豆植株的種植 23.4藥液的制備 23.5選擇性培養(yǎng)基的配制 23.6土壤中大豆疫霉卵抱子的孵育 23.7大豆葉碟制備 2大豆疫霉菌的誘釣 2大豆疫霉菌的分離 23.10鑒定及純化 3土壤誘捕后相關(guān)材料的處理 3DB35/T1219—2011DB35/T1219—2011冃IJ 言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》給出的規(guī)則進(jìn)行編寫(xiě)。本標(biāo)準(zhǔn)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由福建省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭成忠、陳慶河、翁啟勇、李本金、趙健、邱榮洲。DB35/T1219—2011DB35/T1219—201122DB35/T1219—2011DB35/T1219—201111大豆疫霉菌土壤誘捕技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大豆疫霉菌土壤誘捕技術(shù)的土壤誘捕方法、土壤誘捕后相關(guān)材料的滅活處理的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大豆疫霉菌的土壤誘捕。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。1葉碟誘釣法Leafdiscbaitingmethod用感病大豆品種苗期真葉的葉片對(duì)土壤中大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)進(jìn)行誘集，將誘集到的大豆疫霉菌轉(zhuǎn)接到感病大豆品種的葉片上孵育。2.2選擇性培養(yǎng)基Selectivemedium用于土壤中大豆疫霉菌誘捕的含抗生素及抑制其它菌物生長(zhǎng)的胡蘿卜水瓊脂培養(yǎng)基。2.3選擇性誘集Selectivebaiting采用大豆疫霉菌感病品種葉片對(duì)土壤中大豆疫霉菌進(jìn)行誘集，而排除了土壤中其它菌物，再將誘捕后的葉片接種于大豆苗植株上，以提高大豆疫霉菌的分離率。4感病品種Sensitivevariety在土壤誘捕過(guò)程中使用了不含有大豆疫霉菌抗性基因的感病品種Williams或感病品種毛豆75。3土壤誘捕方法1誘捕方法采用葉碟誘釣法。3.2土樣采集及處理在大豆種植區(qū)選擇代表性田塊隨機(jī)取不少于5個(gè)樣點(diǎn)，每點(diǎn)取表層2cm?15cm以內(nèi)的土壤500g,將采集的土壤在室溫下風(fēng)干、混勻，碾碎后過(guò)孔徑為2mm的試驗(yàn)篩，裝入塑料袋密封，4°C條件下保存?zhèn)溆谩?.3大豆植株的種植感病大豆品種播種于以新蛭石為基質(zhì)、直徑為6cm?10cm營(yíng)養(yǎng)杯中，每杯1株，育苗期溫度控制在20C?30C。3.4藥液的制備分別稱取含有效成分0.50g（準(zhǔn)確至0.0002g）的青霉素原粉、含有效成分0.50g（準(zhǔn)確至0.0002g）的利福平原粉、含有效成分0.50g（準(zhǔn)確至0.0002g）的五氯硝基苯原粉、含有效成分0.50g（準(zhǔn)確至0.0002g）的多菌靈原粉，分別置于帶有標(biāo)簽的1000mL容量瓶中；青霉素原粉用蒸餾水溶解并定容，使得最終濃度為lX10fg/mL；利福平原粉用無(wú)水乙醇溶解并定容，使得最終濃度為lX10fg/mL；五氯硝基苯用適量的甲苯溶解后，用0.1%吐溫-80水溶液稀釋并定容，使得最終濃度為5X10fg/mL；多菌靈用適量的二甲基甲酰胺溶解后，用0.1%吐溫-80水溶液稀釋并定容，使得最終濃度為5X10fg/mL；搖勻，使用前按1：1：1：1體積比混合。上述藥液配制時(shí)，可根據(jù)試驗(yàn)的需要相應(yīng)增加或減少配制體積，但所配制成的各種藥液最終有效成分的質(zhì)量體積比應(yīng)保持不變。3.5選擇性培養(yǎng)基的配制稱取200g新鮮胡蘿卜，切成小片后置于組織打碎機(jī)腔中，加入去離子水500mL,啟動(dòng)組織打碎機(jī)搗碎約40s,傾出組織搗碎液，用4層紗布過(guò)濾，濾過(guò)液置于1000mL量杯中，補(bǔ)足去離子水到1000mL,傾入可加熱的容器中，加入瓊脂16g,加熱至瓊脂完全融化，立即分裝于帶棉花或硅膠塞的三角瓶中，在121°C下蒸汽滅菌20min后，冷卻至60°C~70°C（不燙手），加入3.4所配制的藥液4mL,倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中制成平板，備用。3.6土壤中大豆疫霉卵弛子的孵育稱取自然風(fēng)干且過(guò)孔徑為2mm的試驗(yàn)篩的土樣30g,平鋪在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中。將3.4所配制的藥液稀釋100倍，每個(gè)皿緩緩加大刻釋好的藥液12mL,使土壤均勻濕潤(rùn)（土壤含水量大約為35%）,加蓋后用密封膜封緊。倒置于25°C培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育7do3.7大豆葉碟制備用直徑為10mm的打孔器打取感病品種的充分長(zhǎng)大的大豆嫩葉，制成圓形葉碟。3.8大豆疫霉菌的誘釣在盛有孵育后土樣的培養(yǎng)皿中加入蒸餡水16mL,用滅菌過(guò)的吸水紙將培養(yǎng)皿水面的漂浮物清潔干凈后立即加入3.7制備的大豆葉碟，每個(gè)皿放置20片，加蓋后置于25°C黑暗條件下誘捕48h。3.9大豆疫霉菌的分離取出誘捕后的大豆葉碟，在無(wú)菌水中漂洗干凈，轉(zhuǎn)入裝有15mL蒸餡水的培養(yǎng)皿內(nèi)，25°C光暗交替條件（光：暗=3.5：3.5）T孵育7h后，肉眼觀察葉碟上是否出現(xiàn)小黑點(diǎn)。取出葉碟接種于生長(zhǎng)10d~15d的感病大豆植株，在下胚軸近葉處用解剖刀輕輕向下劃約0.5cm長(zhǎng)的傷口，將誘捕后出現(xiàn)小黑點(diǎn)的葉碟貼在傷口處，接種部位用濕棉花包裹。接種后的大豆苗在25°C條件下保濕48h,取下棉花，接種苗DB35/T1219—2011DB35/T1219—2011放入18°C?25°C溫室下正常管理培育，接種3d后觀察接種部位的發(fā)病情況。取病健交界處的組織用3.5所配制的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。3.10鑒定及純化將分離所得到疑似大豆疫霉菌的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，具體的鑒定特征如下：菌落白色，氣生菌絲致密呈棉絮狀；顯微鏡下觀察，菌絲體無(wú)橫隔、分枝處大多呈近直角、分枝基部稍縊縮，少量菌絲形成結(jié)節(jié)狀菌絲膨大體；抱囊梗單生，抱子囊均為頂生式，呈橢圓形，乳突不明顯，抱子囊內(nèi)層出現(xiàn)象明顯，成熟后不脫落，抱子囊成熟后很快釋放游動(dòng)抱子；可產(chǎn)生大量卵抱子，藏卵器具薄壁、球形或近球形，雄器側(cè)生，偶有圍生，卵抱子圓形，內(nèi)外兩層壁，壁光滑。菌體形態(tài)符合上述特征的可認(rèn)定為大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)的菌株。挑取大豆疫霉菌菌落邊緣的單菌絲段，置于3.5制備的培養(yǎng)基斜面上，25C-28C恒溫下黑暗培養(yǎng)8d?10d,當(dāng)培養(yǎng)基斜面上長(zhǎng)滿菌絲后，灌注滅菌過(guò)的液體石蠟密封，置于13C黑暗中保存。4土壤誘捕后相關(guān)材料的處理4.1所有與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的土壤均采用干熱160C滅菌1h